響應(yīng)面法優(yōu)化馬血中S O D超聲波提取工藝研究

熱孜耶·喀日，米麗班·霍家艾合買提，熱合滿·艾拉，許銘強(qiáng)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊830052）

超氧化物歧化酶（SOD）是廣泛存在于生物體內(nèi)的一類金屬酶[1]，它能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，從而能有效清除機(jī)體內(nèi)超氧陰離子自由基，是生物體重要的細(xì)胞防御系統(tǒng)之一[2]，有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、抗輻射和消炎作用[3]。SOD主要存在于血細(xì)胞中，因此要提取SOD，必須使細(xì)胞膜破碎，通常使用的方法有：溶脹法[4]、機(jī)械破碎法、酶溶法、有機(jī)溶劑法。目前，SOD用于延緩人體衰老，防止色素沉著，并治療慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎等癥，也被廣泛地應(yīng)用于生產(chǎn)日用化工品，如SOD化妝護(hù)膚品，對(duì)抗衰老、去除臉面雀斑等有明顯的效果。隨著日用化工產(chǎn)品的發(fā)展及SOD在臨床上的應(yīng)用，SOD的需求量越來越大[5]。我國是一個(gè)傳統(tǒng)養(yǎng)馬大國，有15個(gè)地方品種和11個(gè)培育品種，約占世界馬品種的十分之一。目前，存欄馬匹達(dá)到790萬匹，居世界之首[6]。馬血是一種寶貴的蛋白質(zhì)資源，具有很高的藥用價(jià)值，但對(duì)其提取方面的系統(tǒng)研究還很少。目前，一般從動(dòng)物血中提取SOD的工藝多為正交設(shè)計(jì)，但此方法精確度不高，且不能考慮因素之間的交互作用。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的高效方法，可確定各因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)（響應(yīng)值）的影響，精確地反映因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系[7]。本研究從食品安全的角度考慮，以響應(yīng)面方法優(yōu)化超聲波提取馬血中SOD，考察超聲條件對(duì)提取SOD比活力的影響，以期對(duì)動(dòng)物血資源的綜合開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬血 華菱屠宰場；檸檬酸三鈉、氯化鈉、鄰苯三酚、鹽酸、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白、乙醇 以上皆是分析純。

HH-54數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TD5A-WS臺(tái)式低速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PL203電子天平 梅特勒托利儀器有限公司；DZKW-D-2型電熱恒溫水浴鍋 北京市光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅細(xì)胞的制備 取新鮮馬血與0.38%檸檬酸三鈉體積比為1∶7的溶液，攪拌均勻，以3000r/min的速度離心15min，除去血漿，收集紅細(xì)胞，用2倍體積的0.9%NaCl溶液洗滌3次，在-15℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 為了優(yōu)化超聲波提取工藝條件，選取超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度做單因素實(shí)驗(yàn)；在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定馬血中SOD超聲波提取的最佳工藝條件，實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.3 蛋白質(zhì)含量測定[8]考馬斯亮藍(lán)G-250法測定蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 SOD活性測定[9]鄰苯三酚自氧化法測定SOD活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)SOD提取的影響 準(zhǔn)確取15mL自然解凍的紅細(xì)胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率200W，溫度40℃條件下分別處理5、10、15、20、25min，測定蛋白質(zhì)的濃度和酶的活性。重復(fù)三次實(shí)驗(yàn)，確定合適的超聲時(shí)間，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的延長，SOD比活力也增加，當(dāng)超聲時(shí)間為15min時(shí)，提取液中SOD比活力為76.1U/mg。繼續(xù)延長超聲時(shí)間，SOD比活力隨之降低，這可能是由于超聲波的高強(qiáng)度機(jī)械作用和空化作用使SOD變性失活，因此，確定最佳超聲時(shí)間為15min。

2.1.2 超聲功率對(duì)SOD提取的影響 準(zhǔn)確取15mL自然解凍的紅細(xì)胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率分別為：160、180、200、220、240W溫度40℃條件下處理15min，測蛋白質(zhì)的濃度和酶的活性，結(jié)果見圖2。

通常超聲功率越高，越容易獲得較大的聲強(qiáng)，但超聲功率對(duì)SOD比活力的影響不能一概而論，而要考慮超聲波與介質(zhì)相互作用的程度和提取物的性質(zhì)。由圖2可知，隨著超聲功率的增加，SOD比活力不斷增加，當(dāng)超聲功率在220W時(shí)，提取液中SOD比活力為81.1U/mg；而繼續(xù)增加超聲功率，SOD比活力隨之降低，因此，選擇超聲功率為220W。

2.1.3 超聲溫度對(duì)SOD提取的影響 準(zhǔn)確取15mL自然解凍的紅細(xì)胞置于試管中，加入以3∶1的蒸餾水，攪拌15min后，在超聲功率220W，超聲溫度分別為：15、30、45、60、75℃下分別處理15min，測蛋白質(zhì)的濃度和酶的活性，結(jié)果見圖3。

從圖3可知，超聲溫度在30℃時(shí)，SOD比活力為78.2U/mg，高于30℃后SOD比活力緩慢下降，因?yàn)闇囟雀?，?xì)胞膜在未破碎、SOD未溶出時(shí)，細(xì)胞已經(jīng)變性，導(dǎo)致了溶液中SOD含量下降，比活力降低，另外，高溫也會(huì)導(dǎo)致SOD變性，從而使SOD的比活力降低。

2.2 以SOD比活力為響應(yīng)值的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

利用統(tǒng)計(jì)分析Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表2。

2.2.1 數(shù)學(xué)模型的建立[10]根據(jù)表2所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用響應(yīng)面統(tǒng)計(jì)方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合，建立SOD比活力與超聲時(shí)間、超聲功率、超聲溫度三因子的二次多項(xiàng)數(shù)學(xué)回歸方程：

回歸模型方差分析見表3，模型的p=0.0003＜0.01，說明對(duì)馬血中SOD建立的回歸模型是極顯著的，失擬項(xiàng)p=0.0971＞0.05不顯著，相關(guān)系數(shù)R2=0.9639，表示模型的擬合度良好，實(shí)驗(yàn)誤差較小。三因素對(duì)SOD比活力的影響順序?yàn)椋撼暅囟龋境晻r(shí)間＞超聲功率。因此可以選用此模型對(duì)SOD的超聲波提取工藝進(jìn)行分析和預(yù)測，能確定所得到的二次回歸方程模型是合適的。

2.2.2 響應(yīng)面分析與優(yōu)化 圖4是以SOD比活力為響應(yīng)值的響應(yīng)曲面圖，通過對(duì)相應(yīng)的等高線及響應(yīng)曲面分析，由Design-Expert軟件給出響應(yīng)圖的預(yù)測值，SOD比活力78.3739U/mg，其對(duì)應(yīng)的工藝參數(shù)是：超聲時(shí)間15.02min、超聲功率220.17W、超聲溫度30.56℃。

對(duì)回歸模型進(jìn)行數(shù)學(xué)分析，交互項(xiàng)AC對(duì)SOD比活力的影響顯著。隨著超聲時(shí)間和超聲溫度的上升，SOD比活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。

在模型給出的條件下，按實(shí)際條件確定：超聲時(shí)間15min、超聲功率220W、超聲溫度31℃，在此條件下做3組平行實(shí)驗(yàn)，以檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性。所得的SOD比活力分別為77.5、76.9、78.1U/mg，平均值為77.5U/mg。驗(yàn)證值77.5U/mg和預(yù)測值78.3739U/mg非常接近，說明回歸方程可以較真實(shí)的反映各篩選因素的影響，建立的模型與實(shí)際情況比較吻合，再次證明該回歸模型的可行性。

3 結(jié)論

采用超聲波萃取法從馬血中提取SOD，利用實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件Design-Expert，通過響應(yīng)面分析法建立馬血SOD超聲波提取工藝的數(shù)學(xué)回歸模型，并對(duì)各因子對(duì)SOD比活力的影響進(jìn)行了分析，得出影響馬血SOD提取的各因素順序依次為：超聲溫度＞超聲時(shí)間＞超聲功率；馬血SOD超聲波提取工藝的最佳參數(shù)為：超聲時(shí)間15min、超聲功率220W、超聲溫度31℃，在此條件下，SOD比活力為77.5U/mg。

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