楚雄川滇金絲桃總黃酮含量的測(cè)定*

陸學(xué)明，李雪玲，安 洋，王振吉

(楚雄師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系，云南 楚雄 675000)

川滇金絲桃 (Hypericum forrestii N.Robson)，灌木，屬于藤黃科 (Guttiferae)，金絲桃屬 (Hypericum)，在國(guó)內(nèi)主要分布于產(chǎn)四川西部 (天全、康定)，云南西部，西北部，在中部地區(qū)的昆明、楚雄一帶也有分布，一般生長(zhǎng)于海拔1500—3800米，資源豐富［1］。

川滇金絲桃是一種常見(jiàn)的藥用植物［2］?？捎糜谥委熆┭?，吐血，腸風(fēng)下血，外傷出血，風(fēng)濕骨痛，口鼻生瘡，腫毒，燙火傷。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，該屬植物中金絲桃素類、口山酮類、黃酮類等成分是其抗抑郁、抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗炎等的活性成分，具有重要的開(kāi)發(fā)前景［3］。金絲桃中的二蒽酮類化合物金絲桃素是抗抑郁的主要有效成分之一［4—5］。金絲桃苷是金絲桃屬植物的特征性成分之一，具有較強(qiáng)的鎮(zhèn)痛，保護(hù)腦缺血損傷，保護(hù)心肌缺血再灌損傷等作用［6］。金絲桃屬的貫葉連翹提取物有抗抑郁、抗病毒作用，作為藥物已在德國(guó)、英國(guó)等國(guó)家上市，主要用于治療抑郁癥、甲型和乙型肝炎及艾滋病等［7］。所以對(duì)金絲桃內(nèi)總黃酮含量的研究具有較大的意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)金絲桃科植物黃酮的研究，主要有貫葉金絲桃［8—12］，長(zhǎng)柱金絲桃［13］，近無(wú)柄金絲桃［14］，腺點(diǎn)金絲桃［15］，短柱金絲桃［16］和尖萼金絲桃［17］的黃酮類化合物含量及分析等方面的研究，結(jié)果表明，不同種類的金絲桃科植物黃酮類物質(zhì)的含量和組成都有一定差異［8—17］。在貫葉金絲桃的黃酮類化合物研究中，對(duì)不同地域生長(zhǎng)的貫葉金絲桃的總黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，總黃酮含量可從2.17%到7.24%變化［11］，因此金絲桃科植物生長(zhǎng)環(huán)境不同黃酮含量相差也較大。目前，對(duì)川滇金絲桃的研究較少，通過(guò)本研究可初步明確楚雄分布的川滇金絲桃中總黃酮含量。

對(duì)黃酮類化合物的提取方法主要有浸提法，回流法，微波提取法和超聲波提取法。根據(jù)相關(guān)報(bào)道，微波提取法在4種方法中得率最低，浸提法，超聲提取和回流法較高，但三者沒(méi)有顯著性差異［18］，本實(shí)驗(yàn)選用乙醇浸提法，并對(duì)此方法進(jìn)行多因素研究，以提高提取效率，找到最佳的提取工藝。

目前利用金絲桃開(kāi)發(fā)的制劑品種還為數(shù)較少，劑型單一，主要集中在金絲桃素，金絲桃苷等藥物制劑，限制了其臨床應(yīng)用，因此金絲桃屬植物還有待于進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。在云南楚雄分布有豐富的川滇金絲桃資源，分布廣，原料易得，四季可采。如何充分、合理開(kāi)發(fā)川滇金絲桃資源，為其臨床應(yīng)用提供充分的藥學(xué)、藥理學(xué)依據(jù)，還有待系統(tǒng)地進(jìn)行研究。本研究對(duì)楚雄地區(qū)川滇金絲桃的開(kāi)發(fā)和利用具有一定意義。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

川滇金絲桃植株 (采自云南省楚雄市紫溪山)

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 (藥品)

無(wú)水乙醇、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、氫氧化鈉、鋅粉、亞硝酸鈉、硫酸亞鐵、硝酸鋁、氨水、三氯化鐵、鹽酸。以上試劑皆為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 原料處理

采集的楚雄川滇金絲桃樣品混合后，莖葉洗凈→陰干→粉碎→備用

2.2 黃酮類化合物的提取

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的川滇金絲桃莖葉粉末，用一定濃度的乙醇溶液于某溫度下水浴浸提一定時(shí)間，提取液濃縮后，將提取液以一定濃度的乙醇溶液于50mL容量瓶中定容，得總黃酮提取液。平行實(shí)驗(yàn)三次。

2.3 總黃酮的定量分析

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取一定量的蘆丁在120℃的恒溫干燥箱中干燥1.5h至恒重，然后準(zhǔn)確稱取蘆丁0.0100g，加70%乙醇溶液溶解后，定容到50mL容量瓶中，搖勻，即得0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。

亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉，在堿性條件下可使總黃酮與鋁鹽形成絡(luò)合物，在可見(jiàn)光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，吸光度值與黃酮濃度服從朗伯—比爾定律。準(zhǔn)確吸取1.00mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于25mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加入10%硝酸鋁溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加入4%氫氧化鈉溶液5.00mL，再用70%乙醇溶液定容至25mL刻度線，搖勻，放置10min，以試劑空白作參比，在440—540nm之間測(cè)定提取液的吸光度，確定測(cè)定波長(zhǎng)。

準(zhǔn)確吸取0.2mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.50mL， 1.00mL， 1.50mL， 2.00mL，2.50mL，3.00mL分別置于25mL比色管中，各加入5%亞硝酸鈉溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加10%硝酸鋁溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加4%氫氧化鈉溶液5.00mL，用70%乙醇溶液定容至25mL刻度線，搖勻，放置10min后。以試劑空白為參比在最大吸收波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 川滇金絲桃總黃酮提取

準(zhǔn)確吸取川滇金絲桃總黃酮提取液0.20mL于25mL比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加10%硝酸鋁溶液0.80mL，搖勻，放置6min;加4%氫氧化鈉溶液5.00mL，用70%乙醇溶液定容至10mL刻度線，搖勻，放置10min，在500nm波長(zhǎng)處以試劑空白為參比測(cè)吸光度。

2.4 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)

2.4.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

按2.2所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別用60%、65%、70%、75%、80%的乙醇為提取劑提取黃酮，并制得樣品液，取樣品液0.20mL按1.2.4.6所示方法顯色后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算提取液中總黃酮的含量，取其平均值;選擇較適宜的乙醇濃度。

2.4.2 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響

按2.2所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別浸提提取0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h、3.0h，按上述方法顯色后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算提取液中總黃酮的含量，取其平均值;選擇較適宜的浸提時(shí)間。

2.4.3 浸提溫度對(duì)提取效果的影響

按2.2所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別設(shè)定溫度為65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，按上述方法制得樣品液，顯色后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算提取液中總黃酮的含量，取其平均值;選擇較適宜的浸提溫度。

2.4.4 液料比對(duì)提取效果的影響

按2.2所述的實(shí)驗(yàn)方法，分別用液料比(mL/g)為:15:1、20:1、25:1、30:1、35:1，同樣按上述方法制得樣品液，顯色后在500nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，平行實(shí)驗(yàn)三次，計(jì)算提取液中總黃酮的提取率，取其平均值，選擇較適宜的液料比。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃酮定性檢驗(yàn)結(jié)果

按實(shí)驗(yàn)2.3.1的操作，以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制波長(zhǎng)在440～540nm范圍內(nèi)的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度與波長(zhǎng)關(guān)系圖，結(jié)果表明，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在500nm處有最大吸收峰，故選擇500nm為最大吸收波長(zhǎng)。

總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:A=11.306C－0.0063，r=0.9997，表明蘆丁在0.01～0.07mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 提取條件的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 乙醇濃度對(duì)提取效果的影響

按2.4.1操作，采用不同濃度的乙醇溶液浸提楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮，結(jié)果表明，黃酮的提取率隨乙醇濃度的增大而增高，當(dāng)乙醇濃度70%時(shí)達(dá)到最大值，此后隨著乙醇濃度的升高，黃酮的提取率有所下降，說(shuō)明從楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中提取總黃酮時(shí)，采用70%的乙醇溶液為提取劑可獲得較好效果。

3.2.2 浸提時(shí)間對(duì)提取效果的影響

按2.4.2操作，改變浸提時(shí)間提取楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮，結(jié)果表明，浸提時(shí)間在2.0 h時(shí)黃酮的提取率達(dá)到最大值，浸提時(shí)間高于2.0 h以后，黃酮的提取率有下降的趨勢(shì)，因此從楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中提取總黃酮時(shí)，浸提的最佳時(shí)間確定為2.0h可獲得較好效果。

3.2.3 浸提溫度對(duì)提取效果的影響

按2.4.3操作，改變浸提溫度提取提取楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮，結(jié)果表明，總黃酮的提取率隨著溫度的升高而增大，70℃時(shí)到達(dá)最大，而當(dāng)溫度高于70℃時(shí)，總黃酮的提取率隨著溫度的升高而降低，因此楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中提取總黃酮時(shí)，浸提的最佳溫度確定為70℃可獲得較好效果。

3.2.4 液料比對(duì)提取效果的影響

按2.4.4操作，采用不同液料比提取楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮，結(jié)果表明，在其他條件不變的情況下，隨著溶劑的用量加大，提取率逐漸增大，當(dāng)液料比為30:1時(shí)，提取率達(dá)到最大，之后再增加溶劑的量，提取率基本保持不變，這說(shuō)明從提取液中析出的總黃酮類化合物達(dá)到平衡，因此液料比為30:1可達(dá)到較好的效果。

綜合上述幾個(gè)條件，從溶劑的揮發(fā)損耗、生產(chǎn)速率、生產(chǎn)成本和總黃酮提取提取率幾個(gè)方面考慮，選擇70%的乙醇溶液為提取劑、浸提時(shí)間2.0h、浸提溫度70℃、液料比為30:1(mL/g)提取楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮可獲得較好效果。在此條件下用混合川滇金絲桃樣品進(jìn)行三次平行試驗(yàn)，分別測(cè)得提取液的吸光度為0.753，0.753，0.751，取平均值0.752，通過(guò)回歸方程計(jì)算得到黃酮的濃度為0.06698mg，提取率為16.745%。在此條件下黃酮的提取率較高。

采用乙醇浸提法提取楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中的總黃酮，此方法操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求較低。通過(guò)改變乙醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度以及液料比，研究了各因素對(duì)楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中黃酮提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中總黃酮的適宜提取條件為:70%的乙醇溶液，浸提時(shí)間2.0h，浸提溫度70℃，液料比30:1(mL/g)，在此條件下黃酮的提取率較高達(dá)16.745%。根據(jù)已有資料，貫葉金絲桃中總黃酮含量高達(dá)9.25%［12］，新疆腺點(diǎn)金絲桃中總黃酮含量為11.69%［15］，長(zhǎng)柱金絲桃中總黃酮含量為6.523%［13］，因此云南楚雄地區(qū)川滇金絲桃中總黃酮的含量較高，楚雄地區(qū)川滇金絲桃莖葉中有著豐富的黃酮類化合物資源，且分布較廣，資源豐富，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

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