紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

吳藝飛 ，丁茁荑 ，肖杰 ，周曉波 ，李兵

（1.湖南省蔬菜研究所，長沙，410125；2.湖南省蔬菜工程技術(shù)研究中心；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院；4.恒基兆佳（湖南）房地產(chǎn)發(fā)展有限公司）

紅菜薹（Brassica compestrisssp.chinensisvar.pupureaHort.）為十字花科蕓薹種白菜亞種的變種，是原產(chǎn)于我國長江流域的一種地方特色蔬菜。依靠常規(guī)雜交育種選育一個穩(wěn)定、純合的材料需要3～5 a，耗工、耗時，而通過小孢子培養(yǎng)獲得單倍體后進(jìn)行人工加倍，只需一個世代就可獲得純合的二倍體，作為雜交育種的親本材料，從而大大加速育種進(jìn)程。因此，小孢子培養(yǎng)在紅菜薹遺傳和育種中越來越受到重視。

1 研究概況

游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究始于20世紀(jì)70年代初。為了排除花藥壁和絨氈層組織的干擾，直接了解小孢子胚胎發(fā)生的機理，1973年法國學(xué)者Nitsch和Norreel設(shè)計了一種從花藥中直接分離小孢子的方法，將分離出來的小孢子置于液體培養(yǎng)基中進(jìn)行薄層培養(yǎng)。這一方法最早用在曼陀羅、矮牽牛和煙草等茄科模式植物上，20世紀(jì)80年代以后在一些禾本科農(nóng)作物、蕓薹屬植物上開始研究。1982年德國學(xué)者Lichter[1]率先在油菜上進(jìn)行小孢子培養(yǎng)并獲得胚狀體，他發(fā)現(xiàn)小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體和再生植株要大大多于花藥培養(yǎng)，從而引起眾多育種工作者的關(guān)注。此后，游離小孢子培養(yǎng)在很多其他作物上相繼獲得成功，成為很多植物品種改良的重要手段[2～4]。

2004年王濤濤等[5]對紅菜薹進(jìn)行小孢子培養(yǎng)并率先獲得成功。目前在紅菜薹小孢子培養(yǎng)方面不斷取得新的進(jìn)展，研究表明，供體植株的基因型、小孢子發(fā)育階段、親本植株的生理狀態(tài)、培養(yǎng)基組成成分及添加物、小孢子培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件等因素對小孢子的產(chǎn)胚率影響相當(dāng)大，但再生植株群體的倍性復(fù)雜，給育種工作帶來很大的難度[6]。

2 影響小孢子胚產(chǎn)率的因素

2.1 供體植株的基因型差異

關(guān)于供體植株的基因型與小孢子胚產(chǎn)率的關(guān)系研究很多，盡管所用的材料種類、培養(yǎng)方法等不盡相同，但幾乎所有的研究結(jié)果都表明，不同基因型之間胚胎的發(fā)生頻率差異非常大，同一作物不同品種采用相同的培養(yǎng)條件，出胚多的基因型的出胚率是出胚少的基因型的幾十甚至數(shù)百倍[7，8]。

王濤濤等[5]對5個紅菜薹品種進(jìn)行小孢子培養(yǎng)中，只有3個產(chǎn)生了胚狀體。張秀武等[9]通過試驗將供試材料分為3類：易成胚材料、較易成胚材料和難成胚材料，并認(rèn)為產(chǎn)胚量高的親本，其后代攜帶親本中較易產(chǎn)胚的基因，因此也有較高的胚產(chǎn)出率。由此可見，小孢子胚產(chǎn)率同很多其他遺傳性狀一樣，也是受基因調(diào)控的性狀。

2.2 生長條件、取材時期和小孢子發(fā)育階段

大多數(shù)小孢子培養(yǎng)試驗證明，供體植株所處的生長條件，如溫度、日照時數(shù)、株齡以及植株所處的環(huán)境等對胚產(chǎn)率影響非常大，研究人員提出，在小孢子培養(yǎng)試驗中，應(yīng)盡量使供試植株生長在溫度為15～20℃ 和14～16 h的長日照條件下，以便得到更好的培養(yǎng)效果。在無人工氣候室的情況下，宜把供體植株花期安排在冬季或早春，以避開秋季高溫、短日照等不利環(huán)境對小孢子培養(yǎng)的影響。鄧耀華等[10]認(rèn)為，紅菜薹小孢子培養(yǎng)受氣溫影響很大，當(dāng)氣溫達(dá)到10℃以上即可進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，紅菜薹小孢子培養(yǎng)的最適溫度為15℃。

除溫度、光照等因素外，植株的株齡對小孢子胚胎發(fā)生率也有一定影響。一般宜選取盛花前期或盛花期無病害植株上健康飽滿的花蕾進(jìn)行培養(yǎng)。適宜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時期為單核靠邊期和雙核早期（花蕾長 2～3 mm，花瓣/花藥=1/3～4/5）。

2.3 預(yù)處理和預(yù)培養(yǎng)方法

①低溫預(yù)處理 即接種前將花蕾放在4℃下進(jìn)行低溫處理。鄧曉輝等[11]的研究結(jié)果表明，接種前將供試花蕾放在4℃條件下進(jìn)行低溫處理，對小孢子胚產(chǎn)率影響不大，但當(dāng)處理時間超過5 d后，胚誘導(dǎo)率下降明顯，他認(rèn)為雖然低溫能減緩小孢子發(fā)育速度，但是對小孢子胚狀體發(fā)生的數(shù)量無影響，因此接種前的低溫處理對小孢子胚誘導(dǎo)率的影響效果不明顯。而張秀武等[9]的試驗結(jié)果表明，低溫處理2 h的花蕾胚誘導(dǎo)率高于未經(jīng)低溫處理的花蕾，但隨著處理時間的延長，胚發(fā)生率反而大幅下降，處理4 d以后基本沒有胚狀體產(chǎn)生。

②高溫誘導(dǎo) 即將接種后的小孢子置于33～35℃高溫下進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)。鄧曉輝等[11]的研究認(rèn)為，高溫誘導(dǎo)改變了小孢子的發(fā)育方向，使其由花粉發(fā)育轉(zhuǎn)向胚狀體發(fā)育，因此是誘導(dǎo)小孢子出胚的關(guān)鍵因素，但處理時間以12～36 h為宜，超過60h后，小孢子的生理代謝受到嚴(yán)重破壞，小孢子活力大大下降，從而導(dǎo)致胚狀體誘導(dǎo)率下降。韓笑等[12]的研究也認(rèn)為，高溫?zé)峒ぬ幚硎谴龠M(jìn)細(xì)胞分裂和改變小孢子發(fā)育方面的主要條件，將花椰菜小孢子接種后放在32.5℃高溫下預(yù)處理24 h，產(chǎn)胚量明顯提高。

③小孢子濃度 小孢子培養(yǎng)時，小孢子濃度對培養(yǎng)效率有很大的影響，在一定范圍內(nèi)濃度越高，胚狀體誘導(dǎo)率越高，濃度越低，誘導(dǎo)率越低，這種現(xiàn)象稱之為密度效應(yīng)。不同植物的小孢子培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)濃度不同。肖輝等[13]認(rèn)為，紅菜薹小孢子培養(yǎng)時，最佳的小孢子濃度為5～6個花蕾/皿，用血球計數(shù)板測量密度為1×105～2×105個/mL。

2.4 培養(yǎng)基添加劑

①活性炭 大多數(shù)的研究結(jié)果表明，在培養(yǎng)基中添加適量的活性炭能提高小孢子胚的產(chǎn)率，且能增加子葉形胚的產(chǎn)量，降低畸形胚的數(shù)量。一般活性炭的添加量為0.1%～1.0%，不同品種間有一定差異。活性炭通過吸附培養(yǎng)基中小孢子生長發(fā)育過程中產(chǎn)生的酚類、酮類等有害物質(zhì)，給小孢子創(chuàng)造更好的發(fā)育環(huán)境，從而提高胚狀體誘導(dǎo)率，但因活性炭是無選擇性的吸附，它在吸附有害物質(zhì)的同時也吸附小孢子，因此當(dāng)培養(yǎng)基中活性炭過多時，它也會吸附在小孢子的周圍，使小孢子發(fā)育受阻，抑制胚狀體的發(fā)生，使胚誘導(dǎo)率不再增加，甚至出現(xiàn)下降趨勢[14]。

②外源激素 一般添加的外源激素為6-BA和NAA，6-BA的誘導(dǎo)效果比NAA顯著。張秀武等[9]的研究結(jié)果表明，在一定范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的升高，胚誘導(dǎo)率呈上升趨勢，而畸形胚發(fā)生率也隨之升高，這說明6-BA濃度對胚的形態(tài)及最終形成再生植株的比率影響很大，肖輝等[13]的試驗也證明了這一點。6-BA的作用機理可能為：在游離小孢子體內(nèi)產(chǎn)生與6-BA相結(jié)合的高度專一性和親和力的受體蛋白，有些受體蛋白存在于質(zhì)膜上，與激素相結(jié)合后改變質(zhì)子泵活力和膜的透性；有些受體蛋白存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，與激素結(jié)合后影響DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成，并對一些特殊酶的合成起調(diào)控作用，從而誘導(dǎo)小孢子產(chǎn)生胚狀體。

3 胚狀體發(fā)生及植株再生的研究

3.1 胚狀體的發(fā)生

一般來說，小孢子培養(yǎng)3～5 d開始進(jìn)行第1次細(xì)胞分裂，7～10 d可形成肉眼可見的球形胚，15～20 d可出現(xiàn)心形、魚雷形及子葉形胚。同蕓薹屬多數(shù)蔬菜一樣，紅菜薹小孢子胚發(fā)育也存在不同步性，同一皿內(nèi)可見到各個不同發(fā)育時期的胚，而發(fā)育早期的球形、心形胚較難以誘導(dǎo)成苗，主要是誘導(dǎo)發(fā)育較好的魚雷形或子葉形胚發(fā)育成完整植株。

3.2 植株再生成苗

鄧曉輝等[11]認(rèn)為，將發(fā)育較好的魚雷形或子葉形胚轉(zhuǎn)入固體培養(yǎng)基中，置于4℃下處理10 d后，其出苗率會大大提高。此外，他還通過試驗證明，將子葉形胚接種到含瓊脂1.0%以上的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3周后，再轉(zhuǎn)至含瓊脂0.7%的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以大大提高胚狀體的再生成苗率，這可能是因為小孢子胚成熟后需要一個相對干燥的生長環(huán)境，因此可通過改變水勢對胚狀體產(chǎn)生一定的水分脅迫作用，從而提高再生植株的質(zhì)量和成苗率。

3.3 再生植株的倍性鑒定

小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)的胚狀體得到的再生植株通常為單倍體。然而紅菜薹在培養(yǎng)過程中有較高的自然加倍的現(xiàn)象，從而導(dǎo)致再生植株倍性復(fù)雜，并非都是單倍體。因此，為了確定再生植株的倍性情況，對產(chǎn)生的植株進(jìn)行倍性鑒定很有必要。目前一般通過以下幾種方法對再生植株進(jìn)行倍性鑒定。

①形態(tài)學(xué)鑒定 從植株的外部形態(tài)特征可以快速鑒定作物的倍性，一般來說單倍體植株個體比二倍體小，植株生長勢也要弱些；通過觀察花培植株的花器官形態(tài)也可鑒別植株的倍性，單倍體植株為高度不育。

②解剖學(xué)鑒定 通過分析葉片保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目來鑒定植株的倍性，單倍體植株保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體數(shù)目比二倍體植株少得多，且差值不受基因型的影響。也可通過比較植株氣孔大小的差異來鑒定植株的倍性，同部位單倍體植株的氣孔長度、寬度和周長均小于二倍體植株的。

③細(xì)胞學(xué)鑒定 細(xì)胞學(xué)鑒定植株倍性的方法是根尖壓片法，紅菜薹單倍體的染色體數(shù)目為10條（n=x=10），二倍體為20 條（2n=2x=20）。如果觀察到花培得到植株的根尖染色體數(shù)為體細(xì)胞的1/2，即可確定花培植株是單倍體。

④DNA含量的測定 流式細(xì)胞儀（DNA flow cytometry）可以快速準(zhǔn)確地測定植株DNA含量，從而確定植株的倍性，準(zhǔn)確率可達(dá)99%以上。如果花培得到的植株DNA含量為二倍體植株的1/2，則可確定再生植株是單倍體。

3.4 再生植株的染色體加倍

可通過對小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的單倍體植株進(jìn)行染色體加倍獲得雙單倍體（即DH）。由小孢子培養(yǎng)得到的單倍體植株有自然加倍的現(xiàn)象，但不同植物加倍的比例有差異，所以對單倍體植株進(jìn)行人工加倍也是很有必要的。

張建軍等[15]將不同材料接種在含秋水仙素的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)可提高人工誘導(dǎo)葉菜類四倍體的效率，且未發(fā)現(xiàn)倍性嵌合體，認(rèn)為通過組織培養(yǎng)方法誘導(dǎo)加倍效果比常規(guī)誘導(dǎo)加倍效果好。丁瑜等[16]采用秋水仙素浸泡油菜小孢子培養(yǎng)獲得的再生單倍體植株根系的方法，使二倍體數(shù)從45%提高到75%。在紅菜薹上，還未見有利用含秋水仙素的固體培養(yǎng)基對其進(jìn)行染色體加倍的報道。由于花培得到的胚狀體再生植株均為無菌苗，如果采用根尖浸泡和植株生長點滴定的方式加倍，需要多次滴定，操作上比較繁瑣，且容易出現(xiàn)組培苗被感染或死亡的危險。因此，采用含秋水仙素的培養(yǎng)基培養(yǎng)單倍體進(jìn)行加倍的方法，在成功加倍單倍體的同時會增加植株感染的風(fēng)險，另外，添加秋水仙素的具體濃度尚不清楚。

4 近年來小孢子培養(yǎng)在育種上的應(yīng)用

謝冰等[17]對小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的西葫蘆DH群體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，其DH群體遺傳多樣性豐富，有明顯的超親優(yōu)勢，有利于篩選出優(yōu)異的自交系。姚星偉等[18]的研究也表明，供體雙親的性狀決定了后代群體性狀的分離程度，雙親差異程度越大，DH群體分離類型越多，選擇效率越好。陳斌等[19]從辣椒DH群體中分離出抗TMV和CMV的超親抗病資源。李真等[20]從甘藍(lán)型油菜DH群體中獲得極端抗旱基因型和極端不抗旱基因型，為抗旱相關(guān)研究及育種提供了材料。河南省農(nóng)科院通過小孢子培養(yǎng)先后育成了豫生1號、豫新6號、豫新50、豫新60和豫新58等多個大白菜品種。北京市蔬菜研究中心也利用該技術(shù)育成了桔紅心大白菜等品種。而小孢子培養(yǎng)應(yīng)用在紅菜薹育種上的文章鮮有見報，可能是由于紅菜薹為地方特色蔬菜，研究起步比較晚，難度較大，因此研究工作大多集中在胚狀體的誘導(dǎo)和植株成苗上。

5 存在的問題和展望

經(jīng)過20多a國內(nèi)外育種專家的共同探索，植物游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)不斷改進(jìn)，在某些植物上已經(jīng)形成了較為完善的技術(shù)體系。相對于其他作物而言，紅菜薹小孢子培養(yǎng)的出胚率比較低，很多基因型材料甚至不產(chǎn)胚、培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性差、胚狀體植株成苗效率不高、白化苗、玻璃化苗現(xiàn)象比較嚴(yán)重等，使其在育種中的應(yīng)用具有一定的局限性，因此迫切需要提高小孢子培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用效率，建立完善、高效的紅菜薹小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。

今后應(yīng)在有機物、不同激素的最佳配比、培養(yǎng)方法改進(jìn)、與易出胚品種雜交擴大基因型反應(yīng)范圍等方面進(jìn)一步研究，提高小孢子產(chǎn)胚率，減少畸形胚的發(fā)生，提高再生植株的成苗率，同時，將通過小孢子培養(yǎng)與分子生物學(xué)方法及植株遺傳學(xué)方法相結(jié)合，對胚狀體發(fā)生的分子調(diào)控機制進(jìn)行研究，以期達(dá)到人工調(diào)控單倍體培養(yǎng)的目的，從而建立高效、穩(wěn)定的獲得DH群體的游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。

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