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    RET原癌基因C634R突變合并G691S、R982C多態(tài)性致多發(fā)內(nèi)分泌腺瘤病2A型的家系研究并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

    2013-04-01 01:38:34陳平楊國慶谷偉軍金楠巴建明母義明竇京濤
    解放軍醫(yī)學(xué)雜志 2013年4期
    關(guān)鍵詞:原癌基因嗜鉻細(xì)胞樣癌

    陳平,楊國慶,谷偉軍,金楠,巴建明,母義明,竇京濤

    多發(fā)內(nèi)分泌腺瘤病2型(multiple endocrine neoplasia type 2,MEN2)是一種由基因突變引起的顯性遺傳病,臨床上比較罕見。MEN2有3個(gè)亞型,分別是MEN2A、家族性甲狀腺髓樣癌(familial medullary thyroid cancer,F(xiàn)MTC)和MEN2B。MEN2A的患者以甲狀腺髓樣癌(90%)、單側(cè)或雙側(cè)的嗜鉻細(xì)胞瘤(50%)、甲狀旁腺功能亢進(jìn)(20%~30%)為特征,約占MEN2患者總數(shù)的75%。以往文獻(xiàn)報(bào)道MEN2的發(fā)病與RET原癌基因突變有關(guān)[1],不同位點(diǎn)突變導(dǎo)致的疾病可表現(xiàn)出不同的特征,而我國MEN2A患者以634位外顯子突變?yōu)橹鱗2]?,F(xiàn)就解放軍總醫(yī)院收治的1例MEN2A患者及其家系進(jìn)行研究。

    1 資料與方法

    1.1 臨床資料收集 進(jìn)行家系調(diào)查,繪制家系圖。收集先證者及家系中其他成員病史等相關(guān)資料。①實(shí)驗(yàn)室檢查:血、尿、便常規(guī),血生化,24h尿3-甲氧基4-羥基苦杏仁酸(VMA)測定,全血糖化血紅蛋白(HbA1c)測定,甲狀腺功能測定,性腺功能檢查,血清皮質(zhì)醇及血清促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)節(jié)律測定,臥立位試驗(yàn),生長激素測定,血清類胰島素生長因子-I(IGF-I)測定,骨代謝檢查。②影像學(xué)檢查:胸部正位X線片,甲狀腺及腎上腺超聲,腎上腺M(fèi)RI檢查。③術(shù)后病理結(jié)果。

    1.2 研究方法 經(jīng)知情同意,取先證者及其家系共11名成員外周抗凝血5ml,采用酚/氯仿抽提法提取人血白細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行測序。對先證者RET基因的所有20個(gè)外顯子進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列(表1)采用Primer Premier 5進(jìn)行設(shè)計(jì),由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司合成。50μl反應(yīng)體系,其中Taq聚合酶、dNTP由大連寶生物公司提供。每個(gè)外顯子的擴(kuò)增反應(yīng)根據(jù)引物退火溫度的不同采取不同的降落PCR(touchdown PCR)反應(yīng)參數(shù)。對擴(kuò)增后的產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行粗測后,送三博遠(yuǎn)志公司進(jìn)行測序。

    表1 RET原癌基因外顯子引物序列及擴(kuò)增片段長度Tab. 1 Primers used to amplify exons of the RET proto-oncogene and amplified fragment length

    2 結(jié) 果

    2.1 病例資料 先證者,男,35歲,因“陣發(fā)心悸、頭痛10年余,再發(fā)1年”于2012年2月12日收入解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科?;颊?0年前無明顯誘因出現(xiàn)陣發(fā)性心悸、頭痛,頭痛呈搏動(dòng)性,每次持續(xù)1~2min或10min左右,休息可緩解。發(fā)作時(shí)測血壓升高,收縮壓達(dá)200mmHg以上,伴面色蒼白,偶有大汗、右上腹疼痛。在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行相關(guān)檢查后診斷為“右側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤”,行“腹腔鏡腫瘤切除術(shù)”,術(shù)后病理報(bào)告“嗜鉻細(xì)胞瘤”。術(shù)后患者癥狀完全緩解,無類似發(fā)作。1年前患者再次出現(xiàn)陣發(fā)性心悸、頭痛,性質(zhì)同前,運(yùn)動(dòng)時(shí)易誘發(fā),每次持續(xù)10min左右,伴右側(cè)季肋區(qū)隱痛,未予特殊處理。1個(gè)月前于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院就診,行MRI檢查示“雙側(cè)腎上腺及腎門多發(fā)占位,考慮嗜鉻細(xì)胞瘤可能”,超聲檢查發(fā)現(xiàn)“雙側(cè)甲狀腺實(shí)質(zhì)性占位病變”。查24h尿VMA 154.3mg(正常值1~8mg/d,下同),為進(jìn)一步檢查及治療赴我院就診?;颊呷朐汉蟛檠⒛?、便常規(guī)未見明顯異常;骨代謝示:骨鈣素30.49ng/ml(14~46ng/ml)、全段甲狀旁腺激素41.93pg/ml(15~65pg/ml)、維生素D 34.0ng/ml(20~32ng/ml)、總I型膠原氨基端延長肽89.93μg/L(20~76μg/L)、β-膠原降解產(chǎn)物0.661ng/ml(0.3~0.58ng/ml);血生化示:鈣2.38mmol/L、無機(jī)磷1.40mmol/L、游離鈣1.21mmol/L,肝腎功能無異常。全血HbA1c6.2%,血清甲狀腺素(TT4)117.2nmol/L (55.34~160.88nmol/L),血清三碘甲狀腺原氨酸(TT3) 1.64nmol/L(1.01~2.95nmol/L),血清游離T4(FT4) 14.80pmol/L(10.42~24.32pmol/L),血清游離T3(FT3) 4.45pmol/L(2.76~6.3pmol/L),血清促甲狀腺激素(TSH) 4.48mU/L (0.35~5.5mU/L)。性激素測定示:血清睪酮15.55nmol/L(8.4~28.7nmol/L)、血清雌二醇168.76pmol/L(≤353.1pmol/L)、血清黃體生成激素4.13mU/ml(1.5~9.3mU/ml)、血清卵泡刺激素6.19U/L(1.4~18.1U/L)。0∶00am、8∶00am、4∶00pm血清ACTH分別為2.33、9.08、3.49pmol/L,0∶00am、8∶00am、4∶00pm皮質(zhì)醇分別為65.4、290.0、219.9nmol/L,節(jié)律無異常。血清生長激素0.061μg/L,IGF-I 134ng/ml。臥立位試驗(yàn)提示患者腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)對體位變化有反應(yīng)。胸部正位X線片未見異常。腎上腺超聲示雙側(cè)腎上腺區(qū)偏低回聲結(jié)節(jié)。甲狀腺超聲示甲狀腺多發(fā)結(jié)節(jié)。甲狀腺穿刺病理示左葉、右葉均含鈣化結(jié)節(jié),穿刺組織內(nèi)見浸潤性生長的小圓細(xì)胞,并有淀粉樣物質(zhì)沉積,符合髓樣癌表現(xiàn)。免疫組化染色顯示,腫瘤細(xì)胞CgA(+),Syn(+),Calcitonin(+),CD56(+),Ki-67+(<5%),TG(-),TTF-1(+),CK(+)。行相關(guān)檢查后予以鹽酸酚芐明術(shù)前準(zhǔn)備,后轉(zhuǎn)泌尿外科行后腹腔鏡下左腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤切除術(shù),術(shù)后病理回報(bào):“(左側(cè))腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,腫瘤大小8.5cm×5.5cm×3.0cm,腫瘤未累及包膜,局部疑似侵犯脈管,周圍可見少許腎上腺組織”。免疫組化:CgA(+),Syn(+),S-100(+),CK(-),Inhibin(-),MelanA(-)。后又于我院普外科行“雙側(cè)甲狀腺癌根治術(shù)+右頸前淋巴結(jié)清掃術(shù)”,術(shù)后病理回報(bào):“左葉及峽部,右葉及峽部甲狀腺髓樣癌”。術(shù)后甲狀腺及腎上腺腫物組織HE染色切片見圖1。

    圖1 先證者甲狀腺及腎上腺腫物組織切片(HE染色)Fig. 1 Tumors pathologic specimens of the proband's thyroid gland and adrenal gland (HE staining)

    圖2 多發(fā)內(nèi)分泌腺瘤病2A型患者家系圖Fig. 2 Pedigree of the investigated MEN2A family↗∶ The proband; □∶ Normal male; ○∶ Normal female; ∶ Male patient; ●∶ Female patient

    對患者及其他10位親屬進(jìn)行基因篩查,家系圖見圖2。此家系中先證者35歲,同時(shí)患有雙側(cè)腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤及甲狀腺髓樣癌,血鈣、磷及全段甲狀旁腺激素指標(biāo)正常,超聲檢查未發(fā)現(xiàn)甲狀旁腺增生及腺瘤表現(xiàn)。家系成員Ⅱ-3于35歲時(shí)被診斷為腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤,目前37歲,行甲狀腺超聲未見占位表現(xiàn)。家族成員Ⅰ-2在約42歲時(shí)因“甲狀腺腫瘤”曾于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院先后行4次手術(shù)治療,術(shù)后病理不詳,目前62歲,無嗜鉻細(xì)胞瘤表現(xiàn)。

    2.2 基因測序分析 先證者(Ⅱ-5)及其他2位家系成員(Ⅰ-2、Ⅱ-3)存在如下3個(gè)位點(diǎn)的錯(cuò)義突變:①RET基因第634密碼子TGC>CGC突變,致其編碼的半胱氨酸變?yōu)榫彼幔虎诘?91密碼子GGT>AGT突變,致其編碼的甘氨酸變?yōu)榻z氨酸;③第982密碼子CGC>TGC突變,致其編碼的精氨酸變?yōu)榘腚装彼?。其余家系成員均不存在以上突變?;驕y序結(jié)果如圖3所示。

    3 討 論

    RET原癌基因位于10號染色體長臂(10q11.2),含20個(gè)外顯子,于1985年被首次發(fā)現(xiàn)。1993年與1994年均有文獻(xiàn)證實(shí)MEN2A、FMTC和MEN2B由RET基因的胚系突變引起[1,3-4]。RET基因編碼一種跨膜的酪氨酸激酶受體,由胞膜外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)酪氨酸激酶功能區(qū)組成。RET蛋白的胞外區(qū)與其他酪氨酸激酶受體不具有同源性,可分為半胱氨酸富集區(qū)和鈣黏著蛋白樣配基結(jié)合區(qū)。RET原癌基因所編碼的RET蛋白對人的腸神經(jīng)和其他一些自主神經(jīng)的發(fā)育以及腎臟發(fā)育、精子形成等都具有重要作用。基因突變所導(dǎo)致的RET功能失活可導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸病、先天性中樞性低通氣綜合征、先天性腎及輸尿管發(fā)育不全(congenital anomalies of the kidney or urinary tract,CAKUT)等疾病,而RET蛋白功能異常激活可導(dǎo)致MEN2。

    圖3 RET基因野生型(左)與MEN2A家系先證者突變型(右)測序圖Fig. 3 Sequencing results of the wild type RET gene (left)and mutant (right) of the proband with MEN2A

    文獻(xiàn)報(bào)道的可導(dǎo)致MEN2A發(fā)病的常見胚系錯(cuò)義突變位于10號外顯子(609、611、618和620密碼子)和11號外顯子(630密碼子及634密碼子),這些密碼子參與編碼胞外富半胱氨酸區(qū)。MEN2A有85%的病例涉及第634密碼子的突變,其中最多的為C634R[5]。2001年歐洲MEN指南建議對MEN2患者及其家屬應(yīng)從RET基因第10、11、13、14、15、16外顯子開始進(jìn)行篩查,如未發(fā)現(xiàn)突變則對余下的外顯子進(jìn)行篩查[6]。

    本研究對患者RET基因的所有外顯子進(jìn)行了測序,共發(fā)現(xiàn)3處錯(cuò)義突變。其中C634R突變是MEN2A最常見的突變(85%的MEN2A涉及634密碼子突變,其中52%為C634R)。周瑜琳等[2]曾對我國15個(gè)MEN2A家系進(jìn)行基因分析,發(fā)現(xiàn)被研究的所有MEN2A患者RET原癌基因突變均位于第634位密碼子。姚斌等[7]曾在一個(gè)MEN2A家系的患者中檢出RET原癌基因DelD631雜合缺失突變;張少玲等[8]曾在一個(gè)MEN2A家系患者外周血DNA中檢出RET原癌基因1893-1895DelCGA雜合缺失突變。我國目前已報(bào)道的可致MEN2A的RET基因突變以634位密碼子的突變?yōu)橹?,較國外單一。634位密碼子所編碼的半胱氨酸位于胞外的半胱氨酸富集區(qū),突變導(dǎo)致半胱氨酸殘基變?yōu)榉前腚装彼釟埢?,與半胱氨酸殘基的RET蛋白單體形成分子間二硫鍵,產(chǎn)生畸變的二聚體,使胞內(nèi)的酪氨酸激酶被異常活化,導(dǎo)致促絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)激活增強(qiáng)并降低p18、p27水平,從而導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[9]。

    早在1994年即有研究認(rèn)為G691S是一種單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)[10-12]。Bounacer等[10]曾經(jīng)報(bào)道,輻射誘導(dǎo)的甲狀腺上皮腫瘤患者中G691S多態(tài)性的檢出率高于甲狀腺散發(fā)腫瘤及正常甲狀腺,而輻射誘導(dǎo)的甲狀腺腫瘤伴C細(xì)胞增生的患者中有88%與G691S相關(guān)。Elisei等[13]曾對106例散發(fā)的甲狀腺髓樣癌患者與106位年齡、性別、種族、地區(qū)匹配的對照人群RET基因的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行對比分析,發(fā)現(xiàn)G691S多態(tài)性在甲狀腺髓樣癌患者組中檢出的概率(27.83%)要明顯高于對照組(18.86%,P=0.029),而其他3個(gè)多態(tài)性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而推斷G691S多態(tài)性具有遺傳修飾作用。Borrello等[14]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)G691S增強(qiáng)了K666E的轉(zhuǎn)化活性,并認(rèn)為G691S是一種有功能的多態(tài)性并起著調(diào)控作用。

    Chatterjee等[15]對122例CAKUT患者進(jìn)行基因分析,發(fā)現(xiàn)1例13歲的男性患兒繼承了來自其健康父親的RET基因G691S、R982C雙突變和健康母親的GFRa1基因G443D突變,導(dǎo)致其發(fā)生了CAKUT(患者表現(xiàn)為腎臟發(fā)育不全、腎臟結(jié)構(gòu)異常、腎臟異位、巨輸尿管和膀胱輸尿管反流等),后又通過蛋白印跡法對其致病機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)G691S或者R982C突變單獨(dú)存在時(shí)不會(huì)影響MAPK(RET蛋白下行信號的效應(yīng)器)活性,而當(dāng)G691S、R982C突變同時(shí)存在時(shí),膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cellderived neurotrophic factor ,GDNF)依賴的MAPK磷酸化作用幾乎完全喪失。

    根據(jù)以往研究報(bào)道,C634R突變會(huì)導(dǎo)致RET蛋白形成畸變的二聚體,從而引起下行信號傳導(dǎo)通路的異常激活,G691S、R982C雙突變同時(shí)存在可導(dǎo)致下行信號傳導(dǎo)通路一定程度上的失活。而本研究家系中的3位患者同時(shí)存在以上3個(gè)位點(diǎn)的突變,臨床上表現(xiàn)為甲狀腺髓樣癌和嗜鉻細(xì)胞瘤,為典型的MEN2A表現(xiàn),不存在先天性巨結(jié)腸病、先天性低通氣綜合征、CAKUT等RET蛋白失功能性疾病,在腫瘤發(fā)生的類型和年齡上與以往報(bào)道的單純C634R突變患者無明顯差異,提示當(dāng)C634R、G691S、R982C突變同時(shí)存在時(shí),對RET蛋白功能的影響仍然以C634R突變所致的異常激活為主,從而導(dǎo)致MEN2A的發(fā)生。

    綜上所述,對MEN2患者及其親屬進(jìn)行基因篩查可以從基因水平做出診斷,同時(shí)可發(fā)現(xiàn)家系中潛在的患者并在適當(dāng)時(shí)間段采取干預(yù)措施。根據(jù)2009年ATA發(fā)表的指南所推薦的干預(yù)措施,存在C634R突變屬C級風(fēng)險(xiǎn),攜帶此突變的患者應(yīng)于5歲前行甲狀腺切除術(shù)并進(jìn)行終生替代治療,8歲開始篩查嗜鉻細(xì)胞瘤和甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥[5]。本家系中患者Ⅱ-3及Ⅱ-5共育有4個(gè)子女,經(jīng)基因篩查發(fā)現(xiàn)4位子女無一人繼承其父輩的致病突變?;颊撷?3至今39歲,仍未有甲狀腺髓樣癌表現(xiàn),在向患者介紹疾病相關(guān)知識后建議其行甲狀腺切除術(shù)并替代治療。

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