衣霉素對順鉑誘導人宮頸癌細胞凋亡的影響

徐冶，李質馨，曹慧玲，于洋，劉師兵，王曉軍

順鉑(cisplatin，CDDP)是臨床廣泛用于治療實體瘤的有效化療藥物之一，但其毒副作用和治療中的獲得性耐藥限制了其應用[1]。順鉑通過損傷DNA殺死腫瘤細胞的機制已被普遍認可[2-4]，但有報道認為順鉑能誘導內質網應激和非核依賴的凋亡信號活化[5-7]。本課題組在用人宮頸癌HeLa細胞進行的研究中也發(fā)現(xiàn)了明顯的內質網應激 (endoplasmic reticulum stress，ER stress)現(xiàn)象，但其與順鉑化療作用之間的關系還不清楚。為此，本研究采用內質網應激誘導劑衣霉素(tunicamycin，TUNI)與順鉑合用，觀察增加內質網應激水平對順鉑誘導HeLa細胞凋亡的影響，探討順鉑誘導的內質網應激在腫瘤化療中的作用，為臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和試劑 順鉑為山東齊魯制藥有限公司產品(批號∶ 705021CF)，用生理鹽水配制成1000mg/L的儲存液，過濾除菌，4℃保存，用時采用IMDM培養(yǎng)基(Gibco公司)稀釋至所需濃度。前Caspase-3(pro-Caspase-3)、活化Caspase-3(active-Caspase-3)兔單克隆抗體及Caspase-4兔多克隆抗體購自英國Abcam公司，磷酸化H2AX組蛋白(?-H2AX)兔單克隆抗體購自美國Cell Signalling公司，蛋白質二硫鍵異構酶(PDI)小鼠單克隆抗體、β-actin小鼠單克隆抗體、FITC標記的山羊抗兔抗體、Texas-red標記的山羊抗小鼠抗體均購自美國Santa Cruz公司，辣根酶標記山羊抗兔抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠抗體購自北京中杉金橋生物公司，Hoechst 33342熒光染料、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購于北京鼎國公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)、衣霉素(tunicamycin，TUNI)購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人宮頸癌HeLa細胞株由吉林大學白求恩醫(yī)學院病理生理學系惠贈，用含10%小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)的IMDM培養(yǎng)基(青、鏈霉素各100U/ml)于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 MTT法檢測 取對數(shù)生長期細胞以5×104/ml密度接種于96孔板，每孔100μl，培養(yǎng)24h。實驗分組設置：衣霉素(5mg/L)組、順鉑(6mg/L)組、衣霉素(5mg/L)與順鉑(6mg/L)聯(lián)合給藥組、陰性對照組(不加藥物)，同時設單加培養(yǎng)液的空白對照，每組設3個復孔。藥物作用12h后每孔加入MTT 20μl，作用4h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150μl，震蕩10min，于Model 680型酶標儀(美國Bio-Rad公司)490nm波長處測定光密度(A490)值，每孔測3次，取平均值。細胞生長抑制率=1－(實驗組A490值－空白組A490值)/(陰性對照組A490值－空白組A490值)×100%。

1.2.3 Hoechst 33342熒光染色檢測細胞核形態(tài)高壓消毒后無菌蓋玻片置于24孔板，取對數(shù)生長期細胞，調整細胞密度為1×105/ml，每孔500μl接種過夜，次日細胞生長至80%融合，實驗分組及處理同1.2.2。藥物作用12h后，棄培養(yǎng)基，加入200μl固定液(4%多聚甲醛)作用10min，吸去固定液，加0.01mol/L PBS洗滌后，吸盡液體，加200μl Hoechst 33342染色液染色5min，再用0.01mol/L PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封固，激光共聚焦顯微鏡觀察。每組隨機選取6個視野，計數(shù)核碎裂細胞比例，重復3次，取平均值。

1.2.4 免疫印跡法檢測凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-4活化 細胞分組及處理同1.2.2。提取細胞總蛋白，定量，取60μg蛋白進行電泳(SDS-PAGE膠濃度12%)，電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入1∶200稀釋前Caspase-3兔單克隆抗體、活化Caspase-3兔單克隆抗體、Caspase-4兔多克隆抗體和β-actin小鼠單克隆抗體，4℃孵育過夜后，用TBST洗3次，再分別加入1∶1000稀釋的相應二抗(辣根酶標記山羊抗兔抗體、辣根酶標記山羊抗小鼠抗體)，室溫孵育1h，TBST洗3次，DAB顯色。上海天能凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 2500R)采集圖像，SPSS 16.0軟件定量分析實驗結果。

1.2.5 間接免疫熒光法檢測PDI、?-H2AX表達細胞爬片及給藥方法同1.2.3。爬片經4%多聚甲醛固定，用含0.1% Triton的PBS作用5min，0.01mol/L PBS洗滌，非免疫山羊血清封閉30min，分別加入一抗(?-H2AX 兔單克隆抗體、PDI小鼠單克隆抗體，1∶200)4℃過夜，0.01mol/L PBS洗滌，分別加入熒光二抗(FITC標記的山羊抗兔抗體、Texas-red標記的山羊抗小鼠抗體，1∶400)作用30min，0.01mol/L PBS洗滌，抗熒光淬滅劑封固，激光共聚焦顯微鏡觀察。FITC的激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm，呈現(xiàn)綠色熒光；Texas-red的激發(fā)波長589nm，發(fā)射波長615nm，呈現(xiàn)紅色熒光。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用One-way ANOVA法，進一步兩兩比較采用Tamhane法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 順鉑及衣霉素對HeLa細胞的生長抑制作用 衣霉素組、順鉑組、聯(lián)合給藥組和陰性對照組的細胞增殖抑制率分別為2.65%±2.71%、19.60%±4.34%、44.69%±7.07%、0，組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。進一步兩兩比較顯示，聯(lián)合給藥組細胞增殖抑制率顯著高于順鉑組(P=0.011)、衣霉素組(P=0.003)和陰性對照組(P=0.006)，順鉑組的細胞增殖抑制率顯著高于衣霉素組(P=0.007)和陰性對照組(P=0.017)，而衣霉素組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 細胞核形態(tài)學改變 Hoechst 33342熒光染色結果顯示，活細胞所發(fā)熒光較弱且均勻，順鉑組和聯(lián)合給藥組部分HeLa細胞核明顯變小并呈現(xiàn)致密強熒光，部分細胞核呈碎塊狀，且聯(lián)合給藥組核碎裂細胞比例(44.5%±5.1%)顯著高于順鉑組(22.7%±3.9%，P＜0.05，圖1)。

圖1 共聚焦顯微鏡下TUNI和(或)順鉑處理后細胞核形態(tài)變化(Bar=20μm)Fig. 1 Morphological changes of nuclear after cisplatin and/or TUNI treatment (Confocal microscope, Bar=20μm)

2.3 凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-4的表達改變免疫印跡法檢測顯示，順鉑組即可見裂解Caspase-3、裂解Caspase-4蛋白表達明顯增加，而聯(lián)合給藥組裂解Caspase-3、裂解Caspase-4蛋白表達顯著高于順鉑組(P＜0.05，圖2)。

2.4 PDI和?-H2AX的表達改變 間接免疫熒光法檢測顯示，陰性對照組胞質內無明顯PDI表達，熒光較弱；衣霉素組、順鉑組的PDI蛋白均呈顆粒狀，分布于核周，熒光較強；聯(lián)合給藥組可見大部分細胞內PDI呈現(xiàn)明顯強熒光，熒光強度明顯高于衣霉素組和順鉑組(圖3)。

對細胞核DNA斷裂標志物?-H2AX進行檢測顯示，陰性對照組及衣霉素組細胞核內未見明顯熒光，順鉑組與聯(lián)合給藥組均可見部分細胞核內出現(xiàn)明顯綠色熒光，但兩組無明顯差別(圖4)，表明衣霉素并未增加順鉑對核DNA的損傷。

圖2 TUNI對順鉑誘導HeLa細胞裂解Caspase-3、Caspase-4蛋白表達的影響Fig. 2 Effects of TUNI on the protein expression of Cleaved caspase-3 and Cleaved caspase-4 in cisplatin-induced HeLa cells(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0.05 compared with cisplatin group; (3)P＜0.05 compared with TUNI group

3 討 論

順鉑是治療宮頸癌的常用化療藥物之一，但后續(xù)的耐藥和毒副作用限制了其使用。雖然順鉑對各種實體瘤具有良好的治療效果，但作用機制還不十分清楚。作為細胞毒性藥物，普遍認為順鉑殺傷腫瘤的作用機制是通過損傷DNA和抑制DNA合成激活多種信號途徑，從而導致細胞死亡[2]。內質網應激是細胞應答環(huán)境因素作用的關鍵反應，研究表明，腫瘤的微環(huán)境變化(葡萄糖耗竭、缺氧)[8]或抗腫瘤藥物可誘導內質網應激，表現(xiàn)為內質網腔內錯誤折疊、未折疊蛋白質聚集以及細胞內Ca2+平衡紊亂等[9-11]。許多參與執(zhí)行內質網應激反應的成分既能促進細胞存活，又能觸發(fā)細胞死亡。內質網應激反應的初始作用是通過建立穩(wěn)態(tài)或使損傷效果弱化而實現(xiàn)對應激細胞的保護，但其穩(wěn)態(tài)維持作用并非無限，當內質網應激變得更嚴重時，這一系統(tǒng)轉為發(fā)揮促凋亡調節(jié)作用，從而觸發(fā)細胞死亡[12]。

在多種細胞凋亡誘導途徑中均存在凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3的激活，裂解形式的Caspase-3可通過裂解特異性底物促進凋亡[13-14]。已有報道證實，順鉑可誘導內質網應激[5-7]。發(fā)生內質網應激時，內質網腔內的PDI表達增加[15-16]。Caspase-4被認為是內質網應激介導凋亡的特異性標志分子之一[17]。本研究證實，順鉑可誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡，其中有內質網應激途徑凋亡的參與；衣霉素可增加凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-4的活化，可能也可通過內質網應激途徑促進凋亡。

為了明確順鉑誘導的內質網應激在腫瘤細胞凋亡中的作用，本研究聯(lián)合應用內質網應激誘導劑衣霉素及順鉑，結果表明順鉑可誘導HeLa細胞發(fā)生內質網應激，衣霉素與順鉑聯(lián)合應用提高了細胞的內質網應激水平，此外，衣霉素增加了內質網應激標志物PDI的表達，但不影響細胞核DNA損傷情況，表明衣霉素是通過提高內質網應激水平而不是通過增加細胞核DNA損傷促進順鉑誘導的細胞凋亡。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，內質網和線粒體之間存在物理性和功能性的聯(lián)系，內質網上的某些凋亡調節(jié)蛋白可以調節(jié)這兩個凋亡調節(jié)關鍵細胞器的功能狀態(tài)，從而決定細胞的生存或死亡[18-19]。既往觀點認為，內質網應激可以啟動促存活機制及死亡程序，特別是在存在持久的內質網應激和細胞器損傷的條件下，這種未折疊蛋白反應 (unfolded Protein response，UPR)信號可以阻止或促進藥物介導的細胞殺傷作用，并且其效果可能取決于腫瘤的類型及所使用的細胞毒性藥物種類?？紤]到治療效果，那些能夠激活UPR促凋亡途徑同時抑制其促存活功能的藥物，可能獲得最大的治療優(yōu)勢。

綜上所述，用內質網應激誘導劑衣霉素增加內質網應激水平，可顯著增加順鉑誘導的HeLa細胞凋亡，表明內質網應激調節(jié)的凋亡途徑在順鉑誘導的HeLa細胞死亡中具有重要作用，該結果為進一步明確順鉑殺傷宮頸癌細胞的作用機制提供了新的線索，也為臨床化療方案的制定提供了實驗依據(jù)。

圖3 TUNI對順鉑誘導Hela細胞PDI蛋白表達的影響Fig. 3 Expression of PDI after cisplatin and/or TUNI treatment Texas red-conjugated secondary antibody, bar=10μm

圖4 TUNI和(或)順鉑對Hela細胞中?-H2AX蛋白表達的影響Fig.4 Effects of cisplatin and/or TUNI on the expression of ?-H2AX FITC-conjugated secondary antibody, bar=20μm

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