一種真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的研究

李小磊,齊 濱,胡 娜,李慧敏,劉 莉

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué),長(zhǎng)春130117)

人參(Panax ginseng C.A.Meyer)為五加科人參屬多年生草本植物,在我國(guó)的應(yīng)用已有數(shù)千年歷史,自古被列為上品,現(xiàn)作為名貴中藥材也已聞名全世界。人參皂苷主要存在于五加科人參屬植物根、莖、葉或花蕾中[1],是人參的主要活性成分之一,現(xiàn)已分離出的人參皂苷有50多種[2]。藥理研究[3-6]表明,人參皂苷具有中樞神經(jīng)抑制、降低細(xì)胞內(nèi)鈣、抗氧化、清除自由基和改善心肌缺血再灌注損傷等作用。稀有人參皂苷(如 Rh1、Rh2、Rg3、Rb3等)更為珍貴 ,在某些難治性疾病如腫瘤治療方面顯示獨(dú)特的療效。因此,如何獲得大量的稀有人參皂苷成為現(xiàn)代藥學(xué)研究的重點(diǎn)。近年來(lái),利用微生物轉(zhuǎn)化法對(duì)人參皂苷進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷,取得了不少有意義的成果,對(duì)轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究也取得了一定進(jìn)展,本實(shí)驗(yàn)利用真菌對(duì)人參根皂苷成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化,對(duì)其中皂苷成分的變化進(jìn)行研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株由所在實(shí)驗(yàn)室提供,人參根總皂苷(宏久公司提供),柱層層析硅膠100-200目及300-400目(青島海洋化工廠分廠),萬(wàn)分之一電子天平(FA2004A,上海精天電子天平),HZQ-F100振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司),手提式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠),BOXUN/博迅潔凈工作臺(tái),高效液相色譜儀(agilent technologies 1200),紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810北京普新通用儀器公司),2f20D暗箱式紫外分析儀,EYELA OSB-2100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,硅膠板規(guī)格：100 nn×100 mm,厚度：0.20～0.25 mm(青島海洋化工廠分廠)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 皂苷的制備 稱取精制后的人參根皂苷10 g溶解于35 mL的甲醇溶液中,在60℃的水浴中攪拌,并且加入15 g硅膠混合均勻,直到混合物顆粒均勻而不膩手,冷卻至室溫,用活化后的硅膠裝柱,用有色筆做標(biāo)記6段。加入氯仿-甲醇(8∶2)的洗脫劑,洗脫。將每一段用甲醇洗脫,分離收集洗脫液,然后濃縮蒸干,將各段分離出的皂苷在水浴蒸干,并研碎稱重。

2.2 紫外測(cè)定皂苷的含量

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品1 mg用80%的甲醇溶液定容于1 mL量瓶中,制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品溶液30、60、90、120、150、180 μ L 分別加入干燥的具塞試管中 ,水浴揮干溶劑,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒溫水浴加熱15 min,取出,流水冷卻2 min,加冰醋酸5 mL,搖勻,隨行試劑做空白得出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 皂苷樣品的制備 將樣品層、1、2、3、4段(其中5段6段為黃色黏稠液體,初步斷定多含糖類物質(zhì),故不做含量測(cè)定)分別配成1 mg含2 mL樣品溶液,分別稱取樣品溶液150 μ L分別加入干燥的具塞試管中,水浴揮干溶劑,各加入新配置的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL,高氯酸0.8 mL,于60℃恒溫水浴加熱15 min,取出,流水冷卻2 min,加冰醋酸5 mL,搖勻,于550 nm處測(cè)定吸收值,計(jì)算質(zhì)量濃度。

2.3 皂苷的薄層層析(TLC)[8]本實(shí)驗(yàn)所用展開劑為氯仿-甲醇-水(7∶3∶0.5)。結(jié)果：一段成分比較單一,糖等雜質(zhì)含量少,故真菌轉(zhuǎn)化選用的皂苷為一段。

2.4 真菌轉(zhuǎn)化皂苷 轉(zhuǎn)化方法按藏韞霞等[9]的方法略作修改。

2.4.1 培養(yǎng)基的制備 瓊脂培養(yǎng)基成分為NaCl 4.5 g/L、蛋白胨12.0 g/L、牛肉浸出粉3.0 g/L和瓊脂粉20.5 g/L,其pH值為(7.0±0.2)。無(wú)菌操作條件下,將菌株接種于瓊脂培養(yǎng)基上,置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)48 h。種子培養(yǎng)基成分為NaCl 5 g/L、K2HPO 42.5 g/L、胰蛋白胨17 g/L、大豆蛋白胨3 g/L和葡萄糖2.5 g/L,其pH值為(7.0±0.5)。無(wú)菌操作條件下,將瓊脂培養(yǎng)基中孢子挖取1 cm2小塊接入種子培養(yǎng)基上,置于轉(zhuǎn)速為150 r/min,30℃的搖床上,培養(yǎng)48 h。

2.4.2 轉(zhuǎn)化反應(yīng) 將人參根皂苷柱分離實(shí)驗(yàn)得到的一段純化產(chǎn)物作為底物,濃度為8 mg/mL,取孢子液30 mL與底物溶液2 mL混合,反應(yīng)在100 mL的小三角瓶中進(jìn)行,將小三角瓶封好后置于空氣浴振蕩器中130 r/min振蕩培養(yǎng),溫度設(shè)為 30℃,培養(yǎng)10 d,從0時(shí)開始每隔24 h取樣1mL,加入300 μ L正丁醇萃取,旋渦混合器上充分混勻后,10 000 r/min離心1 min,取出上層正丁醇相,余下的混合物用300 μ L正丁醇重復(fù)萃取1次,合并2次萃取的正丁醇相,在通風(fēng)櫥內(nèi)55℃水浴濃縮,人參皂苷濃度變大,便于TLC檢測(cè)(每次取樣后直接放到4℃冰箱保存,待5次取樣完畢集中接上述步驟處理)。

2.5 HPLC檢測(cè)

2.5.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SB-C18 600Bar(3 mm ×50 mm,1.8 μ m);流動(dòng)相 ：乙腈(B)-水(A);流速為 1 mL/min;柱溫：30 ℃;波長(zhǎng)：203 nm;梯度洗脫。

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品 Rg3 、Rb1、Rc、Rb2 、Rd 、Rh2 、Compound-K,用色譜甲醇溶解,定容到1 mL的容量瓶中,使其最終濃度為1 mg/mL。

2.5.3 樣品溶液的制備 將揮干溶劑后得到的皂苷稱取1 mg,分別加色譜甲醇稀釋并定容到1 mL的容量瓶中,完全溶解過(guò)0.45 ptm微孔濾膜,取濾液,即得1 mg/mL的供試品。各試樣注入5 μ L于HPLC色譜儀中,測(cè)定峰面積,按外標(biāo)法計(jì)算含量。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由HPLC法可知轉(zhuǎn)化后皂苷成分中Rb2、Rc質(zhì)量濃度基本無(wú)變化,而從得到的人參皂苷質(zhì)量濃度變化圖中可以看出,篩選出的真菌對(duì)二醇型皂苷具有轉(zhuǎn)化活性,Rb1質(zhì)量濃度明顯減少,Rd的質(zhì)量濃度增多,由此得出結(jié)論該真菌能將人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化為Rd。

4 討論

目前,對(duì)于二醇組人參皂苷的轉(zhuǎn)化,通常認(rèn)為是由糖苷酶水解側(cè)鏈糖基而得的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物。微生物轉(zhuǎn)化法比其他方法更有優(yōu)勢(shì)。其成本低,副產(chǎn)物少,確定各種高活性代謝物質(zhì)的生理代謝途徑,篩選可以專一性轉(zhuǎn)化的高產(chǎn)菌種,因此尋找合適的工業(yè)生產(chǎn)條件對(duì)于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)稀有人參皂苷及臨床應(yīng)用具有重大意義。本實(shí)驗(yàn)采用真菌半連續(xù)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化人參皂苷Rb1,通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)化后的皂苷含量進(jìn)行測(cè)定,得到該真菌轉(zhuǎn)化人參皂苷的最適條件,為其規(guī)模化操作提供一定參考依據(jù)。對(duì)于本次試驗(yàn)還有待于考察的因素還有很多,如培養(yǎng)基成分對(duì)真菌的影響,菌濃度和轉(zhuǎn)化溫度對(duì)轉(zhuǎn)化皂苷的影響以及菌種的選擇等都有待于確定和進(jìn)一步研究。

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