3種醫(yī)院中藥制劑微生物限度檢查方法

賁彥鴻,曹東東

(1.廣州市黃埔區(qū)食品藥品檢驗(yàn)所,廣州510700;2.吉林華康藥業(yè)股份有限公司,吉林敦化133799)

醫(yī)院中藥制劑多是由幾味藥材組成的復(fù)方制劑,其中有些藥材具有清熱、解毒、利咽、祛火等功效。這些藥材存在一定抑菌活性,在做藥品的微生物限度檢查時(shí),這些有抑菌活性的藥材可能會(huì)抑制藥品中污染的微生物,從而不能反映藥品的真實(shí)污染情況,為臨床用藥帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。因此,對(duì)含抑菌類成分的制劑采用適當(dāng)?shù)姆椒?消除其抑菌作用達(dá)到真實(shí)準(zhǔn)確的反映藥品質(zhì)量十分必要。本文按2010年版《中國(guó)藥典》[1]要求,對(duì)金錢(qián)草合劑等3種醫(yī)院中藥制劑建立了相應(yīng)的微生物限度檢查方法,并進(jìn)行檢查方法的驗(yàn)證,確立了各制劑可行的微生物限度檢查法,為醫(yī)院中藥制劑的臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 HTY-2000集菌儀(杭1州泰林醫(yī)療器械有限公司);HTY-FC50一次性使用薄膜過(guò)濾器(杭州高德醫(yī)療器械有限公司);JJ1000電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠);CL-32LALP自動(dòng)蒸汽滅菌器(Co.LtdTokyoJapan);GHP-9160隔水式恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);MJ-150FI霉菌培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)

1.2 菌種 大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)9003],均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供,均為第3代菌種。

1.3 培養(yǎng)基 pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號(hào)：1008122)、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100826)、玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基(批號(hào)：100909)、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(批號(hào)：100625)、改良馬丁培養(yǎng)基(批號(hào)：100622),均為北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn),經(jīng)培養(yǎng)基適用性檢查均符合規(guī)定。

1.4 供試品 廣金錢(qián)草合劑(批號(hào)120808,120929,121009);急性咽炎合劑(批號(hào)120810,120927,121020);慢性咽炎合劑(批號(hào)120727,120814,121018)均由廣州市黃埔區(qū)中醫(yī)院藥劑科提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 菌液的制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中,置35℃培養(yǎng)24 h;接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,置25℃培養(yǎng)48 h,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/mL菌數(shù)的菌懸液,備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中,置28℃培養(yǎng) 7 d,加入的 3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,洗脫孢子,吸出孢子懸液至無(wú)菌試管中,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成50～100 cfu/mL的孢子懸液,備用。

2.2 供試液的制備 分別取原液10mL,加入pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液90 mL中,搖勻,作為1∶10供試液,備用。

2.3 驗(yàn)證方法

2.3.1 試驗(yàn)組 1)常規(guī)法分別取供試液和上述制備的菌懸液各1 mL,注入無(wú)菌平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,搖勻,待凝固后倒置于培養(yǎng)箱,于規(guī)定溫度時(shí)間培養(yǎng)(細(xì)菌30～35℃培養(yǎng)3 d,霉菌、酵母菌 23～28℃培養(yǎng)5 d),計(jì)數(shù)。每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿。2)培養(yǎng)基稀釋法：方法同常規(guī)法,供試液為0.2 mL/皿。3)薄膜過(guò)濾法：取供試液 1 mL加入100 mL pH 7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液中,搖勻,過(guò)膜,用緩沖液400 mL分次沖洗濾膜,在最后1次沖洗液中加入菌懸液1 mL,取出濾膜,貼于瓊脂平板上,培養(yǎng),計(jì)數(shù)。

2.3.2 菌液組 取備用菌液1 mL,按菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌數(shù)。

2.3.3 供試品對(duì)照組 取供試液1 mL,按菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定菌數(shù)。

2.3.4 回收率計(jì)算 回收率(%)=(試驗(yàn)組菌數(shù)-供試品組菌數(shù))/菌液組菌數(shù)×100%

2.4 結(jié)果

2.4.1 常規(guī)法 測(cè)定回收率結(jié)果見(jiàn)表1。表1表明,廣金錢(qián)草合劑對(duì)各菌種的回收率均在70%以上,證明無(wú)抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常規(guī)法檢查;急性咽炎合劑和慢性咽炎合劑對(duì)霉菌無(wú)抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常規(guī)法檢查霉菌和酵母菌計(jì)數(shù);對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率均在70%以下,表明2種制劑對(duì)細(xì)菌均有一定的抑制作用。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 測(cè)定回收率結(jié)果見(jiàn)表2。表2表明,采用0.2 mL/皿供試液的培養(yǎng)基稀釋法,急性咽炎合劑對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率均高于70%,可用培養(yǎng)基稀釋法檢查。慢性咽炎合劑對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率仍低于70%,表明該藥對(duì)2種細(xì)菌仍有抑制作用。

2.4.3 薄膜過(guò)濾法 測(cè)定回收率結(jié)果表明,慢性咽炎合劑對(duì)大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率分別為94.8%、90.5%和91.6%,對(duì)3種試驗(yàn)菌的回收率均達(dá)90%以上,該方法可用于該制劑的微生物限度檢查。

表1 常規(guī)法測(cè)定各菌種回收率

表2 培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定各菌種回收率

2.5 微生物限度檢查方法確立

2.5.1 細(xì)菌計(jì)數(shù)法 驗(yàn)證試驗(yàn)表明,對(duì)有抑菌作用的供試品,相應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法和薄膜過(guò)濾法處理,能使被抑制的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率達(dá)到規(guī)定要求。按照上述方法,在檢查前對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的處理,并進(jìn)行3次獨(dú)立平行的驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果顯示,各驗(yàn)證菌菌種的回收率均高于70%,表明試驗(yàn)所采用的細(xì)菌計(jì)數(shù)方法成立。

2.5.2 霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法 驗(yàn)證試驗(yàn)表明,白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均高于70%,霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)法可采用常規(guī)法進(jìn)行檢查。

3 討論

醫(yī)院中藥制劑作為醫(yī)院臨床用藥的一部分,已成為醫(yī)院藥學(xué)的重要組成部分[2]。因此,對(duì)于醫(yī)院制劑進(jìn)行質(zhì)量控制,確立合理的標(biāo)準(zhǔn)成為確保醫(yī)院中藥制劑質(zhì)量的前提。微生物限度檢查是中藥制劑檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的一項(xiàng)必檢項(xiàng)目,尋找可靠、簡(jiǎn)單、快捷的微生物限度檢查方法,通過(guò)方法驗(yàn)證,確立各醫(yī)院中藥制劑切實(shí)可行的微生物限度檢查方法是中藥制劑檢驗(yàn)的一項(xiàng)重要內(nèi)容,也為臨床用藥提供重要保障。本文按照2010年版《中國(guó)藥典》要求,對(duì)3種醫(yī)院中藥制劑的微生物限度檢查方法進(jìn)行確立。

實(shí)驗(yàn)表明,廣金錢(qián)草合劑對(duì)5種試驗(yàn)菌的回收率均高于70%,證明該藥無(wú)抑菌作用,可通過(guò)采用常規(guī)法進(jìn)行微生物限度檢查;急性咽炎合劑有一定程度的抑菌作用,但可通過(guò)培養(yǎng)基稀釋法消除抑菌作用;慢性咽炎合劑有較強(qiáng)的抑菌作用,用培養(yǎng)基稀釋法仍不能完全消除其抑菌作用,選擇薄膜過(guò)濾法將含有的抑菌成分過(guò)濾消除,使該制劑對(duì)5種試驗(yàn)菌的回收率均達(dá)到70%以上。該方法可行有效,也為臨床應(yīng)用醫(yī)院中藥制劑提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社,2010.

[2]李曉東,李娟,郭朝暉,等.幾種醫(yī)院外用中藥制劑微生物限度檢查方法的建立[J].西部中醫(yī)藥,2012,25(2)：25-27.

[3]潘雯,關(guān)倩明,林玲.7種具有抑菌成分中成藥的微生物限度檢查方法驗(yàn)證[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2012,28(6)：623-627.

[4]張慶啟.醫(yī)院藥房中草藥的科學(xué)儲(chǔ)藏與保管[J].長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(3)：554.