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    融合 Th細(xì)胞表位序列 Myostatin重組基因疫苗的構(gòu)建及其對免疫動物肌肉力量的影響*

    2013-03-30 02:06:12劉晨濤王園麗王旭丹
    關(guān)鍵詞:表位質(zhì)粒疫苗

    唐 量,劉晨濤,王園麗,羅 凱,王旭丹

    (陜西師范大學(xué)體育學(xué)院運動分子生物學(xué)實驗室,西安710062)

    肌肉萎縮一直是人們普遍關(guān)注和重視的問題,近年來在肌肉萎縮等相關(guān)疾病研究方面Myostatin作為新的靶分子倍受關(guān)注[1]。Myostatin基因敲除后出現(xiàn)“雙肌”癥狀被認(rèn)為是骨骼肌生長發(fā)育中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子[2]。本課題組近年來報道了 Myostatin重組蛋白的構(gòu)建、表達(dá)和純化[3]及重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量的影響[4]。本實驗在前期研究的基礎(chǔ)上,擬利用基因工程技術(shù)構(gòu)建與 Th細(xì)胞表位TT830-844序列融合的人重組 Myostatin基因疫苗真核表達(dá)載體pVAC-TT-Ms,為重組Myostatin基因疫苗改善肌肉萎縮等病癥的后續(xù)研究提供實驗基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 基因疫苗的構(gòu)建及體外表達(dá)檢測

    1.1.1 實驗材料 真核表達(dá)載體 pVAC1-cms及抗生素 Zeocin為 Invivogen公司產(chǎn)品;pQE30質(zhì)粒和LipofectinTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;核酸片段純化試劑盒和質(zhì)粒純化試劑盒購自O(shè)mega公司;限制性內(nèi)切酶均為 TaKaRa公司產(chǎn)品;兔抗人Myostatin多克隆抗體為 Bethyl公司產(chǎn)品,熒光標(biāo)記羊抗兔二抗購自華美生物工程公司。

    1.1.2 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的構(gòu)建 TT表位序列(Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu)來源于破傷風(fēng)毒素,具有激活Th細(xì)胞的作用。根據(jù)Genebank報道的人Myostatin cDNA序列(No.014793)C-端 330 bp基因片段,合成融合 TT表位的TT-Ms基因序列并克隆至pQE30原核表達(dá)載體,重組質(zhì)粒為pQE-TT-Ms,由上海生物技術(shù)工程公司完成基因片段的合成。

    為構(gòu)建融合TT表位的Myostatin基因真核表達(dá)載體,利用PCR技術(shù)在TT-Ms基因序列5′端和3′端的添加 BamH I和 EcoR I酶切位點。上游引物:5′-CGGGA TC CATT TTG GTC TTG ACT GTG-3′,下游引物:5′-GC GAA TTC TGA GCA CCC ACA GCG-3′,引物由上海生物技術(shù)工程公司合成。

    PCR擴(kuò)增體系:總體積為50μl,其中1μl pQETT-Ms模板質(zhì)粒,5μl的10×PCR緩沖液,5μl MgCl2(25 mmol/L),1μl 4×dNTPs(25 mmol/L),上游和下游引物各 1μl(25μmol/L),1μl Taq DNA聚合酶,用水補(bǔ)足體積至50μl。PCR擴(kuò)增(PCR儀,美國 Bio-Rad):95℃預(yù)變性 2 min后,94℃變性 1min,56℃退火1 min,72℃延伸1 min,循環(huán)共30次,最后72℃再延伸10 min。

    1.1.3 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的鑒定和純化 用BamH I和EcoR I雙酶切pVAC1-cms質(zhì)粒,回收酶切基因片段。PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離后,回收目的片段。將目的基因片段 TT-Ms克隆至真核表達(dá)載體pVAC1-cms,得到重組質(zhì)粒 pVAC-TTMs。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞 DH5α,將陽性克隆轉(zhuǎn)接于LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)約8 h后提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切鑒定和DNA序列分析。將測序正確的質(zhì)粒在含Zeocin抗生素的LB培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增,采用聚乙二醇沉淀法對重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms進(jìn)行純化。

    1.1.4 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞及目的蛋白的表達(dá)檢測 利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)對目的蛋白在真核細(xì)胞中的表達(dá)進(jìn)行檢測。具體方法為:將CHO細(xì)胞用含100 ml/L胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)基于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的 CO2條件下培養(yǎng)。以一定密度分別接種于含蓋玻片的6孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)24~48 h,使80%以上的細(xì)胞貼壁。吸出培養(yǎng)液,在無菌管中各加入2μg純化的pVAC-TT-Ms質(zhì)粒和pVAC1-cms質(zhì)粒,再分別加入100μl無血清和無抗生素的DMEM培養(yǎng)基;在另兩只無菌管中各加入10μl LipofectinTM2000和90μl無血清和抗生素的培養(yǎng)基,室溫放置10 min;分別與前兩管溶液混合,輕輕混勻,室溫放置15 min。分別向脂質(zhì)體和質(zhì)粒溶液中加入800μl無血清無抗生素的DMEM,輕輕混勻,移入洗過的CHO細(xì)胞中,孵箱中培養(yǎng)7 h,換加1 ml含200 ml/L小牛血清無抗生素的DMEM,在轉(zhuǎn)染36 h后收獲細(xì)胞。取出蓋玻片,用預(yù)冷的丙酮固定細(xì)胞10 min,在蓋玻片滴加10%小牛血清,室溫封閉30 min,吸掉。滴加兔抗人Myostatin多克隆抗體后4℃冰箱放置過夜。滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG,37℃孵育60 min。甘油封片后立即于熒光顯微鏡(E1000,日本Nikon公司)下觀察并照相。

    1.2 動物免疫及抓力測試

    由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供雄性BALB/c小鼠,體重 12~14 g,適應(yīng)性喂養(yǎng) 1周后將動物分為三組:正常對照組、空質(zhì)粒對照組和基因疫苗組(n=8)?;蛞呙缃M和空質(zhì)粒對照組小鼠以純化的質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms和 pVAC1-cms作為抗原,每只按100μg股四頭肌內(nèi)注射,每隔14 d免疫一次動物,共免疫4次。正常對照組在相同時間和部位注射相同劑量的PBS。第四次免疫20 d后進(jìn)行抓力測試,方法參考并改進(jìn) Peled-Kamar等報道的動物前肢抓力測試方法。主要步驟為在離地高80 cm處綁緊一根直徑2 mm的繩子,讓小鼠前肢握住繩子,并固定尾部,記錄小鼠掉落前持續(xù)握住繩子的時間,即完成一次抓力測試。每只小鼠抓力測試重復(fù)3次,重復(fù)間隔時間保持一致。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)處理

    所測數(shù)據(jù)用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理,實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,數(shù)據(jù)進(jìn)行組間均值非成對 t檢驗。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒 pVAC-TT-Ms的構(gòu)建

    瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,在約400 bp處有一條與預(yù)期大小相符的條帶(圖1)。TT-Ms基因片段經(jīng) EcoR I和 BamH I雙酶切,與同樣雙酶切的pVAC1-cms質(zhì)粒進(jìn)行連接,得到重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAC-TT-Ms。經(jīng) EcoR I和 BamH I酶切鑒定,發(fā)現(xiàn)在約400 bp處有一條帶(圖2),與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms經(jīng)DNA測序,結(jié)果完全正確(圖 3)。

    Fig.1 PCR production of MyostaitnLane 1:DNA marker;Lane 2:PCR production

    Fig.2 Restriction analysis of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms Lane 1:DNA marker;Lane 2:Restriction production

    Fig.3 Sequencing result of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

    2.2 重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms的純化

    質(zhì)粒純化結(jié)果顯示,pVAC1-cms質(zhì)粒含量為1.25μg/μl,pVAC-TT-Ms質(zhì)粒含量為 1.32μg/μl;pVAC1-cms質(zhì)粒和pVAC-TT-Ms質(zhì)粒OD260/OD 280比值分別為1.78和1.82,證明質(zhì)粒不含蛋白質(zhì)等雜物;電泳結(jié)果顯示純化質(zhì)粒超螺旋、螺旋和線形條帶明晰(圖4)。以上結(jié)果證明純化質(zhì)粒符合轉(zhuǎn)染細(xì)胞的質(zhì)量要求。

    Fig.4 Purification of recombinant plasmids pVAC-TT-Ms

    2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測真核細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá)

    細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測純化質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染36 h后的CHO細(xì)胞。結(jié)果顯示,重組pVAC-TT-Ms質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞明顯著色,而空質(zhì)粒pVAC1-cms轉(zhuǎn)染的 CHO對照細(xì)胞無熒光著色(圖5),證明重組pVAC-TT-Ms質(zhì)粒體外可以在真核細(xì)胞CHO中表達(dá)目的蛋白。

    Fig.5 Detecting the transferring CHOcells with cell immunofluorescence technique(×200)A:CHOcell transfected with pVAC1-cms plasmids;B:CHO cell transfected with pVAC-TT-Ms plasmids;CHO:Chinese hamster ovary

    2.4 重組Myostatin基因疫苗對免疫小鼠抓力的影響

    小鼠抓力測試結(jié)果顯示,對照組小鼠前肢抓力平均時間為(33.50±2.72)s,融合 TT表位的重組Myostatin基因疫苗pVAC-TT-Ms免疫的小鼠前肢抓力平均時間為(47.78±3.51)s,與對照組比較提高顯著,免疫小鼠前肢抓力平均增加了29.88%(圖6A)。為了排除體重對抓力的影響,進(jìn)一步分析免疫小鼠抓力與體重的比值,結(jié)果與正常對照組小鼠比較,基因疫苗免疫小鼠平均增加了24.31%,增加顯著(圖 6B)。

    3 討論

    廢用性肌肉萎縮一直是人們普遍關(guān)注和重視的問題,許多學(xué)者對廢用性肌萎縮的治療進(jìn)行了深入研究,但仍無突破性進(jìn)展。Myostatin作為骨骼肌生長發(fā)育的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子,在廢用性肌肉萎縮方面的研究倍受關(guān)注。

    本實驗選用人重組 Myostatin基因疫苗免疫誘導(dǎo)特異性抗體進(jìn)而抑制其體內(nèi)活性,而構(gòu)建人重組Myostatin基因疫苗的關(guān)鍵是打破免疫耐受。Th細(xì)胞表位TT序列,有利于自身的免疫系統(tǒng)所識別,誘發(fā)免疫反應(yīng)。本實驗在構(gòu)建 Myostatin基因疫苗時N-端融合了Th細(xì)胞表位TT序列,以打破Myostatin免疫時耐受,增強(qiáng)Myostatin基因疫苗的免疫效果。

    Fig.6 Grip test in immunized miceA:Relationship of grip time(x-axis)to body weight(y-axis)for each animal;B:Average value of the grip time/body weight.The average value of the time/body weight of the mice immunized with pVAC-TT-Ms was about 24.31%greater than that of control mice*P<0.05 vs control

    質(zhì)粒pVAC1-cms是一種高效和安全的基因疫苗專用質(zhì)粒。將Myostatin成熟肽基因片段克隆至pVAC1-cms質(zhì)粒IL-2的信號肽序列和胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的跨膜錨定位點序列之間,確保表達(dá)的抗原蛋白被錨定在細(xì)胞的表面,以增強(qiáng)免疫應(yīng)答。重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms由脂質(zhì)體介導(dǎo),轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,使外源目的蛋白整合穩(wěn)定,并高效擴(kuò)增和表達(dá)目的蛋白。

    本實驗將多種優(yōu)勢結(jié)合,首次構(gòu)建融合 Th細(xì)胞表位序列人重組 Myostatin基因疫苗真核表達(dá)載體pVAC-TT-Ms,瞬時轉(zhuǎn)染 CHO細(xì)胞并免疫熒光技術(shù)檢測,目的蛋白在轉(zhuǎn)染的 CHO細(xì)胞中明顯表達(dá)。測定OD260和OD280比值和電泳分析表明,重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms質(zhì)量符合免疫動物時基因疫苗的要求。重組質(zhì)粒pVAC-TT-Ms免疫小鼠可顯著提高免疫小鼠前肢的抓力。

    Whittemore等[5]報道動物體內(nèi)注射 Myostatin的特異性抗體,可抑制 Myostatin的活性,進(jìn)而提高動物骨骼肌質(zhì)量和力量。雖然 Myostatin抗體在治療肌肉相關(guān)疾病的過程中效果良好,由于純化困難、造價昂貴等不便限制了抗體的廣泛應(yīng)用,因此,研發(fā)針對該蛋白主動免疫的疫苗有更好的應(yīng)用前景。下一步課題組計劃比較 Myostatin基因疫苗的量效和時效關(guān)系,分析該疫苗提高免疫動物骨骼肌質(zhì)量和力量的分子機(jī)制,為重組 Myostatin基因疫苗治療廢用性肌肉萎縮等病癥方面的應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

    [1] Elkina Y,von Haehling S,Anker SD,et al.The role of myostatin in muscle wasting:an overview[J].J Cachexia Sarcopenia Muscle,2011,2(3):143-151.

    [2] McPherron A C,Lawler A M,Lee SJ.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member[J].Nature,1997,387(6628):83-90.

    [3] 唐 量,王園麗,張萬金,等.Myostatin基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)、純化與鑒定[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2010,38(6):77-81.

    [4] 唐 量,張萬金,王園麗,等.Myostatin重組蛋白疫苗對小鼠骨骼肌質(zhì)量和力量的影響[J].中國運動醫(yī)學(xué)雜志,2011,30(2):149-153.

    [5] Whittemore L A,Song K,Li X,et al.Inbibition of myostatin in adult mice increnses skeletal muscle mass and strength[J].Biochem Biophys Res Commun,2003,300(4):965-971.

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