尼氟滅酸對(duì)γ-氨基丁酸激活DRG神經(jīng)元電流的作用*

李 麗，李 靜，馬克濤，成洪聚，趙 磊，汪 洋，司軍強(qiáng)△

（1．石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理教研室，2．新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-電生理研究室，石河子832002）

γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）作為一種重要的中樞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)元具有普遍的抑制性作用。GABA在抗焦慮、抗驚厥、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等方面發(fā)揮著重要作用［1］。GABAA受體是一超家族配體門(mén)控離子通道，目前已有至少19個(gè)受體亞單位被成功克隆，已鑒定的GABAA受體主要由α、β、γ和δ構(gòu)成，其中除δ亞基外，每一種亞基均有不同的異構(gòu)體存在（α1-α6、β1-β4和γ1-γ4），α6和γ2又各有兩個(gè)剪接變異體。目前認(rèn)為GABAA受體是由不同亞基構(gòu)成的五聚體，被GABA激活后通過(guò)開(kāi)啟Cl-通道產(chǎn)生抑制作用，其效應(yīng)可被荷包牡丹堿（bicuculline）阻斷。GABAA受體本身作為通道-受體復(fù)合體還有多種藥物的結(jié)合位點(diǎn)，這些藥物結(jié)合位點(diǎn)與GABA識(shí)別位點(diǎn)在構(gòu)像上相互作用，直接或間接參與Cl-通道的門(mén)控過(guò)程，發(fā)揮著加強(qiáng)或抑制GABA的藥理學(xué)作用。一般認(rèn)為GABAA受體包括氯通道和五個(gè)分別供 GABA、苯二氮類(lèi)（benzodiazepine）、巴比妥類(lèi)（barbiturates）、苦味毒（picrotoxin）和麻醉藥的結(jié)合位點(diǎn)［2］，上述藥物可通過(guò)與其相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)作用調(diào)節(jié)GABAA受體對(duì)GABA的反應(yīng)。

非甾體類(lèi)抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是目前臨床使用較為廣泛的一類(lèi)藥物，其通過(guò)抑制環(huán)氧合酶和前列腺素的合成發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用［3］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NSAIDs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元GABAA受體功能也存在著重要的調(diào)節(jié)作用［4］，但NSAIDs對(duì)外周神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元GABAA受體有無(wú)調(diào)節(jié)作用研究甚少。本研究選擇非甾體類(lèi)的抗炎藥物尼氟滅酸（niflumic acid，NFA），觀察 NFA對(duì)外周背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元GABA激活電流的作用。

1 材料與方法

1．1 主要材料

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供的4周齡 SD大鼠（200～250）g，雌雄不限，動(dòng)物質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖酸鉀、膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、荷包牡丹堿（bicuculline）、GABA、NFA、HEPES為 Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．2 主要儀器

Axon 700B放大器（美國(guó)Axon公司）、P-2000拉制儀（美國(guó) Sutter公司）、生物電信號(hào)記錄計(jì)算機(jī)（Axoscope 10．2軟件，美國(guó) Axon公司）。

1．3 細(xì)胞制備［5］

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4周齡的SD大鼠，擊昏、斷頭后迅速切開(kāi)背部皮膚沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨，取出胸腰段脊柱由脊柱正中剖開(kāi)成兩半置于O2飽和的細(xì)胞外液中，外液成分為（mmol／L）：NaCl 150；KCl 5；CaCl22．5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，pH 7．4，溶液滲透壓為340 mOsm。由剖開(kāi)的椎管內(nèi)側(cè)取出神經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)前后根和脊神經(jīng)，在顯微鏡下用角膜剪及游絲鑷剪除相連的神經(jīng)和結(jié)締組織，將分離出的DRG剪碎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，加胰蛋白酶 0．25 mg／ml，膠原酶 0．5 mg／ml后移于試管中，在37℃恒溫溫箱中孵育15 min。然后加入適量胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化。將上述機(jī)械分離20℃～30℃和酶處理的DRG神經(jīng)元離心（1 000 r／min，6 min），然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫20℃～30℃下靜置至少30 min。

1．4 全細(xì)胞膜片鉗記錄［5］

使用Axon 700B放大器（美國(guó)Axon公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，玻璃微電極用P-2000拉制儀（美國(guó)Sutter公司）拉制，電極阻抗約為1～5 MΩ，玻璃微電極所充內(nèi)液成分為（mmol／L）：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES10；EGTA 11，細(xì)胞外液的成分為（mmol／L）：NaCl 150；KCl 5；CaCl22．5；MgCl21；HEPES 10；d-glucose 10，在電極與細(xì)胞膜形成高阻（1～5 GΩ）封接后將膜吸破然，然后調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補(bǔ)償保持電壓為負(fù)60 mV。膜電流應(yīng)用低通濾波（10 Hz）。藥物均采用無(wú)糖外液配制，pH 7．4。給藥系通過(guò)微操縱器移動(dòng)快速換液裝置的排藥管進(jìn)行，排藥管的每個(gè)管口的直徑0．5 mm，管口距所記錄的細(xì)胞100μm，實(shí)驗(yàn)在室溫22℃～30℃范圍進(jìn)行。

1．5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17．0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，給藥前后采用兩均數(shù)的 t檢驗(yàn)來(lái)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的大鼠新鮮分離DRG細(xì)胞呈圓形或橢圓形。實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)胞輪廓清晰，折光性強(qiáng)，直徑在20μm～45μm之間，靜息電位為（-58±6．3）mV（n＝159）。其中部分細(xì)胞連有被離斷的軸索突起殘端，呈卷曲狀。

2．1 GABA激活背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的內(nèi)向電流

被測(cè) DRG的神經(jīng)元中有 94．32%（150／159）對(duì)外加 GABA（0．1～1 000μmol／L）敏感，GABA引起明顯的內(nèi)向電流，且具有明顯的去敏感現(xiàn)象（圖1），即雖然GABA持續(xù)存在且濃度不變，但GABA激活電流達(dá)到頂峰后，電流幅值立即呈指數(shù)衰減直到達(dá)到一穩(wěn)定值。GABA激活內(nèi)向電流的 EC50為（27．3±2．4）μmol／L（n＝7）。100μmol／L的 GABA引起的電流幅值為（1．29±0．72）nA（n＝53）。該電流可被GABAA受體特異性拮抗劑荷包牡丹堿（bicuculline，100μmol／L）幾乎完全阻斷 （n＝6）（圖1），這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果一致［5］。

Fig．1 Effect of bicuculline（100μmol／L）on the GABAA receptor GABA：Gamma aminobutyric acid

2．2 尼氟滅酸激活背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的外向電流

被測(cè)DRG的神經(jīng)元預(yù)加不同濃度NFA（0．1～100μmol／L）20 s，其中 43．75%（21／48）的 DRG神經(jīng)元對(duì)外加NFA敏感，可見(jiàn)不同濃度的NFA可引起DRG神經(jīng)元產(chǎn)生較小的外向電流，且具有濃度依賴性，但沒(méi)有明顯的去敏感現(xiàn)象（圖2）。100μmol／L的NFA引起的電流幅值為（0．27±0．06）nA（n＝12）。

2．3 尼氟滅酸濃度依賴性的抑制GABA激活電流

DRG神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗記錄形成后，胞外給予100μmol／L GABA約5 s，記錄GABA激活電流，外液沖洗4 min后再一次記錄GABA激活電流作為前對(duì)照。預(yù)灌流不同濃度的NFA后，給予相應(yīng)濃度NFA和GABA混合藥物，發(fā)現(xiàn)預(yù)加NFA可降低GABA激活電流的幅值，NFA對(duì)GABA激活電流的抑制具有濃度依賴性，IC50為（27．19±4．87）μmol／L（n＝48）。0．1μmol／L的 NFA對(duì) GABA激活電流幅值的抑制率為（0%±0．09%）（n＝4），與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；1μmol／L、3μmol／L、10μmol／L、30μmol／L、100μmol／L的 NFA均可抑制GABA激活電流幅值，NFA對(duì)GABA激活電流幅值的抑制率分別為（5．32%±3．51%）（n＝6）、（21．3%±4．00%）（n＝5）、（33．8% ±5．20%）（n＝17）、（58．2%±5．82%）（n＝4）、（63．9%±4．12%）（n＝12）（圖3）。但 NFA沒(méi)有改變GABA激活內(nèi)向電流的 EC50值（26．9±2．7）μmol／L（n＝8），與不預(yù)灌流NFA相比，GABA激活內(nèi)向電流的EC50差異無(wú)顯著性（P＞0．05）。

2．4 尼氟滅酸對(duì)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元GABA激活電流翻轉(zhuǎn)電位的作用

GABA激活內(nèi)向電流的翻轉(zhuǎn)電位約為（9．87±1．32）mV（n＝6），但在預(yù)灌流 100μmol／L的 NFA后，GABA激活的內(nèi)向電流翻轉(zhuǎn)電位為（9．64±1．24）mV（n＝4），與不預(yù)灌流 NFA相比，GABA激活的內(nèi)向電流翻轉(zhuǎn)電位差異無(wú)顯著性（P＞0．05，圖 4、5）。

Fig．2 Records of outward current induced by niflumic acid

Fig．3 Records of GABA-activated currents with pretreatment of niflumic acidNFA：Niflumic acid

Fig．4 Tracings of the inverse potential of GABA-activated currents with present and non-present niflumic acidGABA：Gamma aminobutyric acid；NFA：Niflumic acid

Fig．5 Inverse potential of GABA-activated currents with present and non-present niflumic acidGABA：Gamma aminobutyric acid；NFA：Niflumic acid

3 討論

GABA是脊髓主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在初級(jí)感覺(jué)信息傳遞（尤其是傷害性感受）通路的控制中發(fā)揮重要作用。免疫細(xì)胞化學(xué)方法證明脊髓背角IIII層有大量GABA神經(jīng)元，特別是Ⅱ?qū)拥拇蠖鄶?shù)島細(xì)胞是GABA能的，它們的軸突和含囊泡的樹(shù)突與C纖維終末球復(fù)合體中的C末梢形成軸突-軸突型和樹(shù)突-軸突型突觸聯(lián)系。這種突觸前抑制的突觸結(jié)構(gòu)的存在，提示GABA能神經(jīng)元參與對(duì)傷害性信息傳遞的突觸前調(diào)制［5］。DRG神經(jīng)元膜有GABAA及GABAB受體共存已經(jīng)得到證實(shí)。脊髓GABA能中間抑制性神經(jīng)元釋放GABA作用于初級(jí)傳入終末（DRG神經(jīng)元中樞突末梢）的GABAA受體，增加DRG神經(jīng)元 Cl-電導(dǎo)，導(dǎo)致 Cl-外流，產(chǎn)生去極化［6］。因此，當(dāng)GABA作用于脊髓時(shí)，使Ⅱ?qū)覥初級(jí)傳入末梢去極化，由于分流作用導(dǎo)致傳入沖動(dòng)幅度降低，減少遞質(zhì)釋放，產(chǎn)生突觸前抑制，使背角痛敏神經(jīng)元的活動(dòng)減弱，對(duì)初級(jí)感覺(jué)傳入尤其是痛覺(jué)的上傳起到抑制作用［7］。因此，研究DRG神經(jīng)元GABAA受體的作用和被調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)闡明初級(jí)感覺(jué)信息傳入的突觸前機(jī)制具有重要意義。

GABAA受體為配體門(mén)控通道受體，GABAA受體被GABA激活后，導(dǎo)致Cl-通道開(kāi)放，然而通道開(kāi)放后Cl-將內(nèi)流還是外流取決于Cl-的平衡電位與靜息電位的相對(duì)值。而在DRG和交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元等外周神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)元膜上幾乎沒(méi)有鉀-氯轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)［8］，胞內(nèi) Cl-濃度大于胞外，細(xì)胞內(nèi) Cl-濃度較Nernst方程計(jì)算出來(lái)的數(shù)值為高，Cl-的平衡電位較靜息電位為?。ㄖ附^對(duì)值），當(dāng)GABA激活后開(kāi)放Cl-通道時(shí)則產(chǎn)生Cl-外流（內(nèi)向電流）使膜發(fā)生去極化。本實(shí)驗(yàn)中GABA可引起DRG神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的內(nèi)向電流，電流幅值約為（1．29±0．72）nA（n＝53），該電流具有明顯的去敏感現(xiàn)象，并可被GABAA受體阻斷劑bicuculine阻斷，翻轉(zhuǎn)電位在-10 mV左右都與以往的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，表明GABAA受體激活開(kāi)放了Cl-通道［5］。

已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，NSAIDs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元GABAA受體功能也存在著重要的調(diào)節(jié)作用［4］。GABAA受體作為配體門(mén)控離子通道能被很多藥物調(diào)控，包括苯（并）二氮卓類(lèi)、巴比妥類(lèi)、類(lèi)固醇、驚厥劑和麻醉劑［9］。已有報(bào)道，NFA對(duì) GABAA和NMDA受體有調(diào)節(jié)作用［4］。甲芬那酸（一種非甾體抗炎藥物）能直接作用于神經(jīng)元膜的 GABAA受體［10］。NFA也可以作為正性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑作用于α1β2γ2組成的GABAA受體，另外，NFA也能作為負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑作用于α6β2和α6β2γ2組成的 GABAA受體［9］。我們的研究表明，NFA沒(méi)有改變GABA激活內(nèi)相電流的 EC50（約為 30μmol／L）值，但明顯使GABA激活電流最大值減少約60%，表明NFA對(duì)GABA激活電流的抑制作用使非競(jìng)爭(zhēng)性的。但是NFA在背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是直接作用于GABAA受體亞單位的位點(diǎn)，還是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)第二信使途徑磷酸化GABAA受體的亞單位發(fā)揮抑制作用還有待于進(jìn)一步明確。

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