鈣網(wǎng)蛋白介導(dǎo)熱處理對(duì)大鼠骨骼肌適應(yīng)性變化鈣調(diào)機(jī)制的研究*

李煥春，肖國強(qiáng)

（華南師范大學(xué)體育科學(xué)學(xué)院民族體質(zhì)與健康研究中心，廣東廣州510631）

高溫刺激可誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激抵抗，提高保護(hù)力。研究表明，熱應(yīng)激可以增強(qiáng)心肌細(xì)胞抵抗致?lián)p傷因素影響，有效減輕心肌冠脈阻塞和再灌注損傷減輕［1］，并且這種現(xiàn)象也出現(xiàn)在骨骼肌組織中［2，3］。這種熱環(huán)境下發(fā)生的應(yīng)激反應(yīng)是一種全身性的綜合生理反應(yīng)，主要通過產(chǎn)生應(yīng)激蛋白，讓機(jī)體在一定時(shí)間內(nèi)獲得適應(yīng)性保護(hù)，以抵抗不利因素的影響。研究表明，機(jī)體Ca2＋反常是一切組織細(xì)胞損傷的共同途徑［4］，組織細(xì)胞的損傷與Ca2＋變化密切相關(guān)，因此推測高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性保護(hù)可能與機(jī)體內(nèi)鈣調(diào)節(jié)有關(guān)。鈣網(wǎng)蛋白（cal-reticulin，CRT）是一種應(yīng)激性的鈣結(jié)合蛋白，主要參與細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)定性調(diào)節(jié)，由于鈣網(wǎng)蛋白為應(yīng)激性的蛋白，熱刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生的適應(yīng)性保護(hù)，可能與鈣網(wǎng)蛋白的產(chǎn)生有關(guān)，但目前國外鈣與熱應(yīng)激適應(yīng)保護(hù)之間的研究非常少，國內(nèi)尚未見報(bào)道，由于運(yùn)動(dòng)引起的細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度的變化是運(yùn)動(dòng)性骨骼肌損傷的發(fā)生的重要機(jī)制，因此本實(shí)驗(yàn)試圖研究高溫環(huán)境處理后大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)鈣網(wǎng)蛋白的變化，探討鈣網(wǎng)蛋白與肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體鈣及鈣酶的變化，從鈣調(diào)機(jī)制的角度闡明熱處理產(chǎn)生的適應(yīng)性保護(hù)現(xiàn)象，為熱處理在運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

40只體重（140．25±12．34）g清潔級(jí)雄性 SD大鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，在清潔級(jí)動(dòng)物房（溫度為（22±0．3）℃，濕度 50%～60%）喂養(yǎng) 3 d后隨機(jī)分成安靜對(duì)照組組（C）8只和熱處理組32只，所有大鼠自由進(jìn)食，飲水。熱處理組按照熱干預(yù)后的時(shí)間再分成熱處理即刻組（H1）、熱處理后24 h組（H2）、熱處理后 48 h組（H3）和熱處理后 6 d組（H4）（n＝8）。線粒體提取試劑盒和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒由上海Genmed有限公司購買，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2＋含量及Ca2＋-ATP酶活性測試試劑盒由南京建成生物有限公司購買，CRT抗體由 Santa Cruz Biotechnology公司購買。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

在一個(gè)封閉的桑拿環(huán)境中對(duì)大鼠進(jìn)行非麻醉狀態(tài)下的熱處理，以避免大鼠受其他刺激的影響。大鼠共進(jìn)行4個(gè)周期的熱處理，熱干預(yù)方式參照其他熱刺激形式而設(shè)立［5］。整個(gè)熱處理期間，濕度控制在50%左右，并監(jiān)控大鼠肛溫。熱處理4 d為一個(gè)周期，3 d熱干預(yù)，1 d休息。一共4個(gè)周期，熱處理溫度依次遞增，監(jiān)測大鼠直腸溫度達(dá)到預(yù)期值以后維持15 min，每個(gè)周期間大鼠直腸要達(dá)到的預(yù)值溫度為（39±0．5）℃、（39．5±0．5）℃、（40．5±0．5）℃及（41．5±0．5）℃。每次熱處理時(shí)間約為 30～35 min，熱處理期間，嚴(yán)格控制溫度和濕度，并觀察大鼠行為。

1．3 指標(biāo)測試

熱處理完畢后，對(duì)大鼠進(jìn)行宰殺。采用7%水合氯醛（0．4 ml／100 g bw）腹腔注射麻醉。腹主動(dòng)脈取血置于抗凝管，并離心分離血清后放入-70℃冰箱中保存。取腓腸肌進(jìn)行分離，并用4℃生理鹽水清洗后，留液氮中保存待用。采用線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)提取試劑盒分別對(duì)大鼠骨骼肌中的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行提取，提取時(shí)嚴(yán)格按照試劑盒操作流程進(jìn)行。采用甲基百里香酚藍(lán)（MTB）比色法和化學(xué)比色法分別測定線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2＋含量及Ca2＋-ATP酶活性，蛋白免疫印跡 Westen Blot檢測 CRT，對(duì) CRT蛋白條帶采用Image-proplus軟件進(jìn)行分析，并計(jì)算CRT蛋白條帶積分吸光度值（integrated absorbance，IA＝平均吸光度值×面積），用CRT的IA與β-actin IA的比值來衡量其相對(duì)水平。

1．4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 10．0軟件包處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用兩樣本均數(shù) t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果

2．1 熱處理對(duì)大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋-ATP酶活性的影響

熱處理完成后，以 H2組大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋-ATP酶活性值最高，與安靜對(duì)照組C比較呈非常顯著性（P＜0．01），而 H1組與安靜對(duì)照組 C比較，其值也呈顯著性差異（P＜0．05）；線粒體 Ca2＋-ATP酶活性以H1組最高，與安靜對(duì)照組C比較呈顯著性差異（P＜0．05，表 1）。

Tab．1 Ca2＋-ATP activity comparison of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmolPi／（mg pro·h），±s，n＝8）

Tab．1 Ca2＋-ATP activity comparison of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmolPi／（mg pro·h），±s，n＝8）

*P＜0．05，**P＜0．01 vs Cgroup

Group Sarcoplasmic reticulum Mitochondrial C 4．12±0．86 18．03±1．24 H1 6．40±1．29* 27．04±1．76*H2 7．56±0．25** 19．16±2．34 H3 4．78±0．62 18．23±2．31 H4 4．36±0．57 18．18±0．65

2．2 熱處理對(duì)大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋濃度的影響

熱處理完成后，大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)Ca2＋濃度以H2組最高，H1組其次，兩者與安靜對(duì)照組比較呈顯著性差異（P＜0．05）；線粒體 Ca2＋濃度 H1與 H2組值雖高于安靜對(duì)照組C，H3及H4組值雖低于安靜對(duì)照組C，也沒有著差異性（表2）。

Tab．1 Effect of Ca2＋concentration of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmol／g pro，±s，n＝8）

Tab．1 Effect of Ca2＋concentration of rat skeletal muscle in sarcoplasmic reticulum and mitochondrial after heat treatment（μmol／g pro，±s，n＝8）

*P＜0．05 vs Cgroup

Group Sarcoplasmic reticulum Mitochondrial C 64．23±3．14 147．12±32．21 H1 78．56±4．59 154．45±40．30 H2 80．45±6．08* 148．33±21．57 H3 66．15±4．21 146．40±23．18 H4 65．12±0．32 146．51．03±20．24

2．3 熱處理對(duì)大鼠骨骼肌應(yīng)激性鈣網(wǎng)蛋白CRT產(chǎn)表達(dá)的影響

熱處理完畢后，H1、H2、H3組大鼠骨骼肌中應(yīng)激蛋白CRT的表達(dá)量較安靜對(duì)照組C顯著增加，之后出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)（圖1）。

Fig．1 Effect of heat treatment on CRT protein expression A：Western blot of CRT andβ-actin；B：Statistic analysis of band relative intensity**P＜0．01 vs control group

3 討論

動(dòng)物機(jī)體在受熱刺激時(shí)可發(fā)生熱應(yīng)激反應(yīng)，并產(chǎn)生熱適應(yīng)，提高細(xì)胞抗損傷能力。研究表明，機(jī)體在熱應(yīng)激狀態(tài)下，主要通過機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的N0、活性氧等相關(guān)物質(zhì)，啟動(dòng)復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生相應(yīng)的熱休克反應(yīng)，誘導(dǎo)合成應(yīng)激蛋白，來發(fā)揮保護(hù)作用［6］，這種保護(hù)性的應(yīng)激蛋白普遍存在于骨骼肌、心肌、肝、腎和腦等多種組織、器官和細(xì)胞中，在細(xì)胞水平上可逆地調(diào)節(jié)對(duì)刺激的敏感性［7］，提高抗損傷能力，以保持機(jī)體的適應(yīng)性。Ca2＋是機(jī)體內(nèi)重要的生物信號(hào)傳導(dǎo)因子，同時(shí)參與骨骼肌的收縮與舒張。細(xì)胞中的Ca2＋主要集中在線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)中，其濃度的穩(wěn)定依賴于線粒體和肌質(zhì)網(wǎng)的調(diào)節(jié)。肌肉收縮時(shí)，肌質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2＋進(jìn)入胞漿，造成胞漿中Ca2＋濃度急劇升高，肌肉舒張時(shí)，肌質(zhì)網(wǎng)通過膜上Ca2＋-ATP酶參與主動(dòng)攝取 Ca2＋，線粒體對(duì)鈣的調(diào)節(jié)也是通過膜上的Ca2＋-ATP酶來完成，在細(xì)胞漿游離鈣濃度急劇上升時(shí)，線粒體會(huì)攝取聚集在胞漿內(nèi)多余的鈣，因此骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體膜Ca2＋-ATP酶活性變化，也直接影響到骨骼肌的收縮舒張功能。組織細(xì)胞的損傷與Ca2＋濃度的變化密切相關(guān)，細(xì)胞質(zhì)肌網(wǎng)鈣攝取能力的下降，細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣的堆積是造成細(xì)胞損傷的重要原因，熱刺激產(chǎn)生的熱適應(yīng)與抗損傷能力可能與鈣的調(diào)節(jié)有關(guān)，應(yīng)激狀態(tài)下骨骼肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)機(jī)制的適應(yīng)性變化非常重要，這種變化直接影響到骨骼肌的正常生理機(jī)能。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熱處理后骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)H2組Ca2＋濃度最高，H1組其次，且與對(duì)照組比較呈顯著性差異，H3和H4組的值雖然高于安靜組對(duì)照組C，但沒有顯著性差異。對(duì)于細(xì)胞內(nèi)線粒體Ca2＋來說，H1與H2組的值高于安靜對(duì)照組C，而H3，H4組的值低于安靜對(duì)照組C，表明經(jīng)過一段時(shí)間的熱刺激后，大鼠骨骼肌細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的分布發(fā)生了變化，鈣流的重新分布可能為細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)性適應(yīng)提供生理基礎(chǔ)，以抵抗機(jī)體的抗損傷能力。同時(shí)由于骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體對(duì)鈣的調(diào)節(jié)與其膜上Ca2＋-ATP酶活性變化直接有關(guān)，因此Ca2＋-ATP酶也會(huì)發(fā)生適應(yīng)性的變化以滿足對(duì)鈣調(diào)節(jié)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，熱處理后肌質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2＋-ATP酶活性以H2組最高，與安靜對(duì)照組 C比較呈非常顯著性，且 H1、H3及 H4組Ca2＋-ATP酶活性的值都比安靜對(duì)照組C時(shí)要高，其中H1組值與對(duì)照組呈顯著性差異。線粒體膜上Ca2＋-ATP酶活性的變化，以H1組Ca2＋-ATP酶的值最高，與安靜對(duì)照組C比較呈顯著性差異。結(jié)果表明大鼠經(jīng)一段時(shí)間的熱刺激以后，提高了細(xì)胞內(nèi)膜Ca2＋-ATP活性，增強(qiáng)了骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)、線粒體攝取鈣的能力，有利于機(jī)體Ca2＋穩(wěn)定的調(diào)節(jié)，因此推測熱處理誘導(dǎo)刺激產(chǎn)生的保護(hù)性現(xiàn)象可能與細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)Ca2＋的調(diào)節(jié)有關(guān)。

鈣網(wǎng)蛋白是一種應(yīng)激性的鈣結(jié)合蛋白，主要存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2＋大都與鈣網(wǎng)蛋白結(jié)合在一起，是細(xì)胞內(nèi)鈣流的緩沖劑。細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化時(shí)，可以刺激CRT表達(dá)上調(diào)并與Ca2＋結(jié)合來維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的建立［8］，以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，從而保護(hù)細(xì)胞［9］。另外CRT還可以充當(dāng)分子伴侶，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行加工維持蛋白質(zhì)功能以及在減輕細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠在熱處理結(jié)束后，H1、H2、H3組骨骼肌中CRT較安靜時(shí)顯著增加，預(yù)示骨骼肌在熱刺激下產(chǎn)生了保護(hù)性的應(yīng)激反應(yīng)，有利于骨骼肌的保護(hù)。

鈣網(wǎng)蛋白是動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞內(nèi)Ca2＋緩沖劑，肌質(zhì)網(wǎng)對(duì)鈣的調(diào)節(jié)主要通過鈣網(wǎng)蛋白來實(shí)現(xiàn)，其調(diào)節(jié)過程與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上Ca2＋-ATP酶活性密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血損傷的肌肉組織在鈣超載后，會(huì)出現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白表達(dá)上調(diào)，并據(jù)此減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載，來減輕骨骼肌缺血損傷。作為重要的應(yīng)激蛋白，鈣網(wǎng)蛋白與高溫環(huán)境下鈣流變化產(chǎn)生的適應(yīng)性變化之間的研究并不多，且僅有的一些研究也大都集中在短暫熱環(huán)境對(duì)心肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體 Ca2＋及 Ca2＋-ATP酶影響方面。有研究表明，培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在39℃～43℃溫度下Ca2＋顯著增加，同時(shí)大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體鈣含量在熱應(yīng)激后隨溫度升高顯著下降，同時(shí)心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體Ca2＋-ATP酶活力亦明顯降低，心肌能量代謝發(fā)生障礙，心肌鈣穩(wěn)態(tài)嚴(yán)重失調(diào)，并且Ca2＋-ATP酶活力的下降可使細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低，以致膜結(jié)合蛋白的構(gòu)象及生物功能受到影響［10］。Ca2＋升高可激活蛋白酶、磷脂酶、氧化酶系、PKC、ATP酶等Ca2＋依賴性酶，加重生物膜損害和誘發(fā)能量耗盡，導(dǎo)致Ca2＋超載的惡性循環(huán)，促使自由基產(chǎn)生，一定程度時(shí)產(chǎn)生損害細(xì)胞效應(yīng)。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在經(jīng)過半個(gè)月期間的溫度遞增的熱處理后，大鼠骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋-ATP酶活性值并沒有下降，反而升高，同時(shí)骨骼肌肌質(zhì)網(wǎng)中的鈣濃度增加，而線粒體的鈣并沒發(fā)生明顯變化，顯示肌細(xì)胞代謝功能未發(fā)生異常。熱處理后，骨骼肌中的應(yīng)激蛋白CRT在熱處理后48小時(shí)內(nèi)維持在一個(gè)較高的水平，與肌質(zhì)網(wǎng)中鈣濃度的變化趨勢基本一致。本實(shí)驗(yàn)中，可能是首先的熱刺激誘發(fā)了肌細(xì)胞產(chǎn)生了鈣平衡的破壞，使得細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了鈣紊亂，從而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激性的鈣網(wǎng)蛋白，來糾正這種狀態(tài)，并且在連續(xù)的遞增的熱處理過程中，這種糾正現(xiàn)象得到加強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞產(chǎn)生了大量保護(hù)性的鈣網(wǎng)蛋白，對(duì)Ca2＋穩(wěn)態(tài)紊亂的進(jìn)行調(diào)節(jié)，預(yù)示CRT對(duì)熱處理過程中骨骼肌細(xì)胞中鈣平衡的穩(wěn)定起到了積極的作用，因此并未發(fā)生類似心肌鈣平衡失調(diào)的現(xiàn)象。

研究表明，兩個(gè)星期的熱處理可明顯提高機(jī)體在細(xì)胞、器官水平以及整體水平上的對(duì)氧化應(yīng)激、長時(shí)間缺血以及耐熱能力等應(yīng)激的耐受能力，并且這種保護(hù)能力可以維持一定時(shí)間。另外實(shí)驗(yàn)證明，生物體熱應(yīng)激后其體內(nèi)熱應(yīng)激蛋白合成增加，并且應(yīng)激蛋白的保護(hù)能力隨著應(yīng)激后恢復(fù)時(shí)間的推移而增強(qiáng)，當(dāng)恢復(fù)到一定時(shí)間時(shí)，動(dòng)物可以獲得最強(qiáng)的保護(hù)能力，此時(shí)組織的應(yīng)激蛋白將達(dá)到高峰或是處于很高水平，而在此時(shí)間之后，保護(hù)能力又會(huì)跟著下降。本實(shí)驗(yàn)熱處理增強(qiáng)了大鼠骨骼肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋-ATP酶的活性，提高了骨骼肌對(duì)鈣平衡失調(diào)的調(diào)節(jié)，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)方案采取了逐漸升高的熱干預(yù)方式，并且持續(xù)時(shí)間較長，不同于單純一次短暫熱刺激，并最終增加骨骼肌細(xì)胞抵抗損傷的耐受力，提高了細(xì)胞在高溫應(yīng)激狀態(tài)下的適應(yīng)性。

熱處理后，大鼠骨骼肌應(yīng)激蛋白鈣網(wǎng)蛋白顯著增加，參與了大鼠骨骼肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋濃度變化過程，同時(shí)熱處理提高了骨骼肌細(xì)胞肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體Ca2＋-ATP活性，這些過程有利于提高骨骼肌Ca2＋平衡調(diào)節(jié)能力，增強(qiáng)骨骼肌的適應(yīng)性，對(duì)預(yù)防運(yùn)動(dòng)性的骨骼肌損傷有很好的借鑒意義。

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