無憂湯對(duì)CUMS抑郁癥大鼠模型中樞遞質(zhì)5-HT和NE影響的研究

秦 竹唐瑤瑤王 臻

（1.云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.新沂市中醫(yī)院，江蘇 新沂 221400）

抑郁癥是以顯著而持久的抑郁情感或心境改變?yōu)橹饕卣?，與應(yīng)激密切相關(guān)的一類精神疾病[1]。抑郁癥發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，單胺遞質(zhì)假說認(rèn)為其發(fā)生可能與腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)功能失衡有關(guān)，近年來此假說已得到證實(shí)和公認(rèn)。5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）被認(rèn)為是與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系最為密切的腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)。無憂湯為清代陳士鐸《辨證錄》的有效名方，主治不寐，其臨床表現(xiàn)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的早期抑郁癥癥狀十份相似。目前尚未見關(guān)于無憂湯的相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究報(bào)道，臨床上在辨證論治的基礎(chǔ)上使用無憂湯加味治療抑郁癥，能夠有效地緩解和改善患者抑郁癥狀，療效較好。本研究擬制作慢性不可預(yù)見性輕度應(yīng)激（CUMS）抑郁癥模型大鼠，予無憂湯不同劑量灌胃干預(yù)，檢測(cè)治療后模型大鼠腦組織中5-HT與NE含量，初步探討無憂湯治療抑郁癥機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 無憂湯由人參、白芍、當(dāng)歸、酸棗仁、竹茹組成，根據(jù)《方劑學(xué)》[2]古方藥量換算表和《辨證錄》換算法，綜合為人參 15g、當(dāng)歸 15g、竹茹 9g、白芍 15g、酸棗仁 9g，以此量為實(shí)驗(yàn)中藥組中劑量。藥材購(gòu)于云南中醫(yī)學(xué)院門診部，經(jīng)鑒定均為正品。大劑量∶中劑量∶小劑量比為4∶2∶1，按照灌胃劑量煎藥濃縮，分別為濃度4g生藥/mL，2g生藥/mL，1g生藥/mL，存于4℃冰箱備用，用前恢復(fù)至常溫。文拉法辛膠囊（成都康宏藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)：H19980051），25mg/粒，臨用時(shí)用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.3mg/mL的藥液。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 由川大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的清潔級(jí)SD雄性大鼠60只，體重為180～200g。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 5-羥色胺（5-HT）和去甲腎上腺素（NE）ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)于昆明晨綠生物科技開發(fā)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 自制敞箱，WLB-98-F型振蕩器，LSY電熱烤箱，游泳缸，電刺激儀，大鼠固定器，藥物冷凝回流儀，酶標(biāo)儀，恒溫水浴箱，勻漿機(jī)，-20℃冰箱，-80℃冰箱，離心機(jī)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與給藥 將60只大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組10只和抑郁造模組50只，空白對(duì)照組每籠5只飼養(yǎng)，正常飲食飲水，不予任何刺激。抑郁造模組大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后單籠飼養(yǎng)，并接受21d CUMS造模。造模成功后，將抑郁模型組50只大鼠隨機(jī)均分為模型組、文拉法辛組和無憂湯高、中、低劑量組，分別連續(xù)灌胃相應(yīng)藥物或生理鹽水21d，每日1次。

2.2 模型制備 采用孤養(yǎng)結(jié)合慢性不可預(yù)知性輕度應(yīng)激刺激為造模方法，參照Willner等[3]方法：大鼠1只/籠飼養(yǎng)，構(gòu)成孤養(yǎng)模型，在21d內(nèi)接受各種不同的不可預(yù)知的應(yīng)激性刺激，包括電擊足底、冰水游泳、搖晃、熱刺激、夾尾、禁水（24h）、禁食（48h）和晝夜顛倒等。每日隨機(jī)安排一種刺激，平均每種刺激使用2次，使各種刺激成為長(zhǎng)期不可預(yù)知的應(yīng)激性刺激。

2.3 行為學(xué)測(cè)定 行為學(xué)指標(biāo)是判定模型成功與否的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，包括敞箱試驗(yàn)（Open-field test）和蔗糖水消耗試驗(yàn)等，能夠較為全面地模擬人類抑郁癥的行為，評(píng)價(jià)給藥后對(duì)抑郁癥心理行為的影響[4-6]。各組于實(shí)驗(yàn)0d（實(shí)驗(yàn)前）、21d（造模結(jié)束）、42d（給藥結(jié)束）進(jìn)行抑郁行為實(shí)驗(yàn)，一般經(jīng)過2～3周的孤養(yǎng)和CUMS后，大鼠敞箱實(shí)驗(yàn)中的水平與垂直運(yùn)動(dòng)得分均明顯下降，糖水消耗量明顯減少，表現(xiàn)出與抑郁癥患者類似的精神運(yùn)動(dòng)性遲滯、精力減退和對(duì)獎(jiǎng)賞的反應(yīng)性下降等癥狀。

2.4 腦組織樣本制備 將大鼠斷頭，快速在冰盤上分離出腦組織，放入勻漿器中加生理鹽水冰浴磨成勻漿液，4℃高速離心20min（離心速率為18000r/min），取上清液放-80℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

2.5 中樞單胺類遞質(zhì)5-HT、NE的測(cè)定 采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）定量測(cè)定大鼠腦組織勻漿液中5-HT、NE含量。往預(yù)先包被NE、5-HT抗體的包被微孔板中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的5-HT、NE呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，組間比較采用單因素方差分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用（）表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠腦內(nèi)5-羥色胺（5-HT）、去甲腎上腺素（NE）含量明顯降低（P＜0.01），表明腦內(nèi)5-HT、NE降低可能是造成抑郁的原因。與模型組比較，文拉法辛和無憂湯高、中劑量能顯著提高抑郁模型大鼠腦內(nèi) 5-HT、NE 含量（P＜0.05，P＜0.01），無憂湯低劑量能顯著提高抑郁模型大鼠腦內(nèi)NE含量（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE含量（） ng/mL

表1 各組大鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE含量（） ng/mL

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)空白對(duì)照組10模型組 10文拉法辛組 10無憂湯高劑量組 10無憂湯中劑量組 10無憂湯低劑量組 105-HT含量 NE含量8.43±1.57 15.18±3.44▲▲3.71±3.39** 8.21±0.89**6.72±1.98▲▲ 13.77±6.25▲▲7.79±1.68▲▲ 12.90±1.74▲▲7.18±1.62▲▲ 11.64±2.29▲4.62±2.02** 9.34±1.17▲*

4 討論

自Schildkraut J.J.[7]1965年首次提出抑郁癥發(fā)病的單胺遞質(zhì)學(xué)說以來，5-HT、NE被認(rèn)為是與抑郁癥的發(fā)生關(guān)系最為密切的腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)。該假說認(rèn)為，抑郁癥的生物學(xué)基礎(chǔ)是腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放減少或代謝增加而導(dǎo)致其突觸間隙的數(shù)量減少或功能下降[8]。許多學(xué)者通過研究NE的代謝產(chǎn)物3-甲氧基4-羥基苯乙二醇（MHPG）和受體的變化來研究抑郁癥患者腦內(nèi)NE的改變，推測(cè)NE的缺乏可能是由于內(nèi)源性的生成釋放異常或由于NE系統(tǒng)慢性刺激所致的繼發(fā)性耗竭[9-10]。藥理學(xué)研究也表明，大多數(shù)的抗抑郁藥都是通過直接或間接提高腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)突觸間隙的濃度或功能而發(fā)揮作用的。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者腦內(nèi)5-HT、NE含量降低[11]，且隨著藥物的治療和癥狀的改善，5-HT、NE含量逐步提高。

CUMS抑郁模型是目前比較公認(rèn)的一種抑郁癥動(dòng)物模型，其慢性輕度不可預(yù)知性應(yīng)激能升高腦內(nèi)獎(jiǎng)賞刺激的閾值和降低位置偏愛性，與抑郁癥患者的核心癥狀快感缺乏非常相似。重要的是CUMS模型與人類抑郁癥的發(fā)病機(jī)制也極為相似，其不可預(yù)知性的應(yīng)激刺激模擬了人類抑郁癥發(fā)病的機(jī)理，采用的刺激因子與現(xiàn)實(shí)生活中人們經(jīng)常遇到的應(yīng)激性事件的強(qiáng)度更為貼近[4-6]。該模型容易復(fù)制，持久而穩(wěn)定，作為抑郁模型具有較高的價(jià)值，是作為抑郁癥病理生理機(jī)制研究和抗抑郁藥物篩選的最佳模型。

無憂湯為清代陳士鐸《辨證錄》治療不寐癥的有效名方，癥見夜不能寐，恐鬼祟來侵，睡臥反側(cè)，輾轉(zhuǎn)不安，或少睡而即驚醒，或再睡而恍如捉拿，屬于郁證心膽氣虛型，具有補(bǔ)氣養(yǎng)血、養(yǎng)心安神、清心除煩之功用。本實(shí)驗(yàn)證明：無憂湯能夠提高孤養(yǎng)加CUMS抑郁模型大鼠腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和NE的含量，提示無憂湯通過提高大鼠腦內(nèi)單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT和NE的含量或活性，從而達(dá)到治療抑郁癥的目的，以高劑量組效果最好，這也為臨床應(yīng)用無憂湯治療抑郁癥提供基本劑量依據(jù)。

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