補腎填精法對骨折后不同時相骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖影響的實驗研究

王 斌 羅毅文 胡年宏

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院，廣東 廣州 510240）

骨修復(fù)過程類似于胚胎期的骨形成，存在兩種骨化形式，軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，均需要骨折局部聚集數(shù)量足夠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（marrow mesenchymal stem cells，MSCs）[1]。我們以往的實驗及臨床研究發(fā)現(xiàn)中藥骨康方具有補腎壯骨、填精養(yǎng)髓、健脾益氣的作用，骨康含藥血清能促進體外分離骨髓源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖和成骨分化[2-3]，對骨質(zhì)疏松性骨折有良好的治療作用[4]。為進一步證實骨康方具有修復(fù)骨損傷的效應(yīng)，本實驗觀察骨康方對大白兔骨折后不同時相BMSCs增殖能力的影響，為中醫(yī)藥促進骨折早期愈合及與時間相關(guān)性機制提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 4周齡新西蘭白兔20只，清潔級，雌雄不限，體重0.8～1.0kg，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。20只白兔按隨機數(shù)字表法分成4組，即正常對照組、骨折模型組、中藥治療組、西藥治療組，每組5只。4組標(biāo)記后分籠喂養(yǎng)，均予以普通飼料及潔凈自來水飼養(yǎng)，溫度維持在24℃左右。

1.2 橈骨骨折模型制作 正常對照組不作骨折處理。骨折模型組進行右側(cè)橈骨旋轉(zhuǎn)扭轉(zhuǎn)性骨折損傷處理，具體操作方式見文獻[5]。中藥治療組作上述骨折損傷處理后灌胃中藥骨康方。西藥治療組作上述骨折損傷處理后灌胃鈣爾奇D。對動物采用針筒灌藥，正常對照組和骨折模型組灌胃等量生理鹽水。每日給藥1次，連續(xù)給藥21d。

1.3 主要試劑 IMDM干粉、胎牛血清、0.25%胰酶、青霉素和鏈霉素（美國Gibcol公司），PBS緩沖液粉劑（武漢博士德公司），Percoll梯度分離液（美國Pharmacia公司），噻唑藍MTT（上海申能博采生物科技有限公司），二甲基亞砜（DMSO廣州威佳科技公司）。

1.4 藥物制備及給藥量

1.4.1 補腎填精法方藥（骨康方） 骨康方由補骨脂、制淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、白芍、黃芪、菟絲子、丹參、當(dāng)歸、大棗組成。將中藥制成粗粉，首煎將中藥粗粉置8倍溫水中浸泡0.5h，沸騰后文火煎煮4h，注意均勻攪拌，取汁后經(jīng)3層紗布過濾；第2次和第3次煎煮均分別以6倍水文火煎煮2h，取汁，合并3次藥液，置水浴箱內(nèi)濃縮至每毫升含生藥量1.43g（此藥物濃度是按人日用劑量，經(jīng)人-兔體表面積比值折算成相當(dāng)于人臨床劑量，濃縮8倍而成。由廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬骨傷科醫(yī)院制劑室提供，批號：960211）。藥液常溫冷卻后，置4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。根?jù)臨床用藥劑量及新藥研究中動物用藥劑量要求，生藥按劑量9.6g/kg（根據(jù)以往實驗高劑量組增殖、誘導(dǎo)效果最佳[2-3]）配制，相當(dāng)于臨床劑量的20倍，藥物以蒸餾水定容至所需濃度。

1.4.2 西藥 鈣爾奇D（由Wyeth惠氏制藥有限公司提供，批號0501125，每片600mg），根據(jù)“人和動物體表面積折算比率表”進行計算，兔的劑量約為28mg/kg。將鈣爾奇D以蒸餾水定容至所需濃度。

1.5 BMSCs的分離 將4組白兔分別給予3g/L苯巴比妥腹腔注射麻醉，術(shù)區(qū)剃毛、消毒，鋪洞巾，用骨髓穿刺針在T0（創(chuàng)前）、T7（創(chuàng)后第 7 天）、T14（創(chuàng)后第 14 天）、T21（創(chuàng)后第 21 天）分別無菌抽取右側(cè)橈骨骨折部位的骨髓液，緩慢注入含4mL淋巴細(xì)胞分層液試管內(nèi)，2000r/min離心 25min，吸取中間單個核細(xì)胞層，用pH值為7.2的 Hank’s液洗 2次。

1.6 BMSCs流式細(xì)胞儀檢測 取洗滌后的分離液離心后去上清液，加入1mL磷酸鹽緩沖液稀釋，計算濃度。取含1×106個細(xì)胞的液體，離心去上清加100μL磷酸鹽緩沖液重懸，再分別加入熒光抗體CD44-FITC及CD45-RPE 各 10μL，避光孵育 30min，加磷酸鹽緩沖液洗滌2次，去上清加500μL 1%多聚甲醛重懸固定，冰盒保存，送流式細(xì)胞實驗室檢測。含CD44-FITC陽性而CD45-PE陰性的細(xì)胞定為BMSCs，由此測得的該細(xì)胞數(shù)值即為BMSCs構(gòu)成比（BMSCs占總細(xì)胞數(shù)的構(gòu)成比），通過多個構(gòu)成比求其平均值。

1.7 BMSCs的培養(yǎng) 用含體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清的DMEM作為培養(yǎng)液（含青霉素100U/mL、鏈霉素100g/mL、兩性霉素 B 0.25g/mL），將細(xì)胞密度調(diào)至 2×109/L，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃恒溫，含體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3天換液1次，棄除未貼壁細(xì)胞，以后隔天換液，待融合成單層細(xì)胞后，傳代培養(yǎng)。

1.8 形態(tài)學(xué)觀察 通過倒置相差顯微鏡連續(xù)觀察BMSCs的生長情況，觀察細(xì)胞在不同時間段的形態(tài)學(xué)變化。觀察樣本量為6孔。

1.9 四甲基偶氮唑鹽檢測（MTT法） 取生長良好的P3代細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，計數(shù)后將BMSCs以2×104細(xì)胞/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板中（孔內(nèi)各置一無菌蓋玻片），每孔加入1g/L四甲基偶氮唑鹽溶液，0.5mL/孔。細(xì)胞繼續(xù)于37℃避光孵育4h，棄去培養(yǎng)液，每孔加入150μL二甲基亞砜，振蕩培養(yǎng)板直至紫色結(jié)晶完全溶解。于48h時進行MTT檢測，用酶標(biāo)儀測定490nm波長的吸光度（A）值。

2 結(jié)果

2.1 骨康方對兔骨折端BMSCs構(gòu)成比的影響 除T0外，與正常對照組比較，同一時相其他各組兔骨折端BMSCs構(gòu)成比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。中藥治療組不同時相（T7、T21）BMSCs 構(gòu)成比顯著高于其他 3 組（P＜0.01）。見表1。

2.2 各組兔骨折端BMSCs形態(tài)學(xué)觀察 原代及傳代培養(yǎng)：原代培養(yǎng)細(xì)胞48h首次換液，BMSCs呈短梭形貼壁生長，并逐漸呈現(xiàn)集落生長，12～14d達到融合生長，融合成片的細(xì)胞排列有一定的方向性，呈漩渦狀排列，細(xì)胞呈梭形或橢圓形等，見圖1-A。傳代細(xì)胞2～4h迅速貼壁，伸展，細(xì)胞呈均勻生長，細(xì)胞形態(tài)更加單一，5～6h鋪滿瓶底。倒置相差顯微鏡下，剛接種的骨髓中體積較大的單個核細(xì)胞呈球形，懸浮于培養(yǎng)液中。8～10h開始逐漸沉降貼壁，48h少數(shù)貼壁細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣外形，以后細(xì)胞呈克隆均勻分布生長，形態(tài)均一，呈長梭形，見圖1-B。生長期細(xì)胞分裂相多見，細(xì)胞突起互相連接，增殖速度快，兩三天即可傳代，見圖1-C。

表1 各組兔不同時相骨折端BMSCs構(gòu)成比（）

表1 各組兔不同時相骨折端BMSCs構(gòu)成比（）

注：與同時相正常對照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與同時相中藥治療組比較，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只）T21 T0正常對照組5 T7 T14 12.684±1.58412.714±1.168** 12.616±1.233**11.328±1.041**骨折模型組 12.668±2.101 14.262±2.094△** 25.474±2.371△△ 26.894±2.355△△**5中藥治療組 5 12.622±1.793 22.572±3.876△△ 28.332±2.125△△ 36.016±2.324△△西藥治療組 5 12.290±1.378 16.693±1.357△** 26.736±2.670△△ 27.424±2.550△△**

2.3 骨康方對兔骨折端BMSCs增殖能力的影響 中藥治療組不同時相BMSCs增殖能力均顯著高于其他3組（P＜0.01）。見表2。

表2 各組兔不同時相骨折端BMSCs增殖OD值（）

表2 各組兔不同時相骨折端BMSCs增殖OD值（）

注：與正常對照組同時相比較，△△P＜0.01；與同時相中藥治療組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 動物數(shù)（只）T21 T0正常對照組5 T7 T14 0.418±0.0300.436±0.030** 0.451±0.050**0.448±0.050**骨折模型組 0.462±0.060 0.465±0.020** 0.474±0.040** 0.586±0.020**5中藥治療組 5 0.493±0.040 0.804±0.050△△ 0.962±0.040△△ 1.133±0.020△△西藥治療組 5 0.496±0.030 0.502±0.040** 0.538±0.010** 0.932±0.020*△△

3 討論

骨折的愈合實質(zhì)上是骨損傷后的再生過程，也是骨組織的形成過程。現(xiàn)多認(rèn)為，在骨折愈合中直接參與骨折修復(fù)的細(xì)胞主要是BMSCs，這種未分化細(xì)胞具有增殖和自我更新的能力，并且有向骨、脂肪、軟骨組織分化的潛能，因此BMSCs的增殖對骨折愈合具有促進作用[6]。BMSCs的增殖和向成骨細(xì)胞方向分化不僅有利于骨折的愈合，更有利于進行BMSCs的自體移植，無免疫原性且不牽涉到倫理問題，如果利用這一特性對其進行強化干預(yù)則有利于增進骨折的愈合速度，尤其有利于骨折后出現(xiàn)的骨缺損、骨不連及骨折制動后出現(xiàn)的骨質(zhì)疏松等難治性骨科疾病的治療。

中醫(yī)理論認(rèn)為，腎藏精，生髓主骨，腎中精氣的盛衰能夠決定骨骼的強弱，影響骨的代謝。補腎中藥對BMSCs的體外培養(yǎng)及分化已有相當(dāng)?shù)难芯縖7]，但如何提高骨折后不同時相體內(nèi)BMSCs的增殖和促進骨化尚未見報道。本課題前期實驗研究表明骨康含藥血清對BMSCs增殖和成骨分化作用大都基于體外的細(xì)胞培養(yǎng)[2-3]，組織細(xì)胞的生存環(huán)境在很大程度上有異于體內(nèi)，因此運用整體動物口服補腎填精中藥骨康后對BMSCs增殖的影響，更接近于臨床試驗。本實驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：白兔在右側(cè)橈骨旋轉(zhuǎn)扭轉(zhuǎn)性骨折損傷后1周內(nèi)出現(xiàn)BMSCs構(gòu)成比增加，并持續(xù)至第3周；而沒有骨折損傷刺激的白兔BMSCs處于比較低水平的構(gòu)成比狀態(tài)，兩者比較有顯著性差異（P＜0.05或P＜0.01）。因此，骨損傷刺激可誘導(dǎo)活體內(nèi)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，這與謝明等[8]研究結(jié)果一致。兔骨折端BMSCs構(gòu)成比在不同處理方法下不同處理時相變化的趨勢不同，其中中藥治療組不同時相（T7、T21）BMSCs構(gòu)成比顯著高于其他 3 組（P＜0.01）。因此，運用中藥骨康干預(yù)骨折損傷白兔有利于增加BMSCs構(gòu)成比，尤其是對骨折損傷后第3周仍有較強的促進BMSCs增殖作用。

中藥對骨折愈合具有明顯促進作用，特別對于骨延遲愈合和不愈合具有較高的治愈率[9-10]。目前研究大多集中在中藥作用于骨折局部的宏觀水平，而對其促進骨折愈合的細(xì)胞學(xué)及分子學(xué)機制研究較少。眾所周知，骨折愈合是一個復(fù)雜而有序的病理過程，涉及一系列細(xì)胞的募集、增殖及分化。因此BMSCs的增殖對骨折愈合具有促進作用。細(xì)胞增殖在時間上以48h最理想，本實驗運用MTT法檢測各組骨折后BMSCs培養(yǎng)48h時的增殖效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)骨折模型兔骨折端BMSCs增殖能力在不同處理方法下不同處理時相變化的趨勢不同，其中中藥治療組不同時相BMSCs增殖能力顯著高于其他 3組（P＜0.05，P＜0.01），并隨著治療時間的推移呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，這表明中藥骨康具有促進BMSCs增殖的能力，且發(fā)揮增殖作用有一定的時效關(guān)系。

綜上所述，中藥骨康方有利于骨折后白兔體內(nèi)BMSCs構(gòu)成比增加，對BMSCs增殖有明顯的促進作用。由此，我們可以推測，骨康方可以通過在增殖高峰時刻刺激體內(nèi)BMSCs增殖，不斷增加BMSCs數(shù)量，從而增加軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化數(shù)量[11]，促進骨折愈合康復(fù)的速度，縮短康復(fù)時間，其機理還有待進一步研究探討。

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