鋅指蛋白及人工鋅指蛋白對微生物代謝影響的研究進(jìn)展

劉卓，張飛，趙心清，白鳳武

大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116024

鋅指結(jié)構(gòu)域是真核細(xì)胞中最常見的 DNA結(jié)合域，含有鋅指結(jié)構(gòu)域的蛋白被稱為鋅指蛋白。鋅指蛋白在真核生物中分布廣泛，參與 DNA、RNA和蛋白質(zhì)的識別、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，并參與蛋白質(zhì)之間的相互作用[1]。鋅指蛋白對生物體的生長、發(fā)育及代謝具有重要的調(diào)控作用，例如在植物中，鋅指蛋白可調(diào)控花和葉的發(fā)育，并在植物抗逆反應(yīng)中起重要的調(diào)控作用[2-3]，鋅指蛋白對動物的發(fā)育和疾病發(fā)生過程也有重要的影響[4]。鋅指蛋白對細(xì)胞生長和代謝具有重要的調(diào)節(jié)作用，但目前對鋅指蛋白的研究多集中在植物和哺乳動物，對微生物鋅指蛋白的研究相對較少。人工鋅指蛋白是人工轉(zhuǎn)錄因子中研究較多的調(diào)控技術(shù)，近年來在微生物菌株選育中有很多成功的應(yīng)用，但使用的鋅指結(jié)構(gòu)域多來自人類或哺乳動物基因組。本文綜述了近年來微生物中，尤其是原核生物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的鋅指蛋白及其對細(xì)胞基因表達(dá)和代謝功能的作用，并對人工鋅指蛋白技術(shù)在微生物菌株選育中的應(yīng)用進(jìn)行了評述和展望。

1 鋅指結(jié)構(gòu)域

鋅指結(jié)構(gòu)域不僅存在于轉(zhuǎn)錄因子蛋白中，還出現(xiàn)在酶、金屬硫蛋白等細(xì)胞內(nèi)重要的大分子結(jié)構(gòu)中[5-7]。自 1983年首次發(fā)現(xiàn)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的鋅指蛋白 TFIIIA以來[8]，新的鋅指蛋白不斷被發(fā)現(xiàn)。鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子主要包括C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、C3H 以及聯(lián)合型等多種類型，其中以 C2H2型最為常見[1]。典型的C2H2型鋅指由30個左右氨基酸組成，含有一組反向平行的 β折疊與一個含有DNA識別位點(diǎn)的α螺旋，通過疏水作用組裝而成。β折疊上的 2個Cys殘基與 α螺旋上的 2個 His殘基結(jié)合一個 Zn2+離子穩(wěn)定其結(jié)構(gòu)，由于其結(jié)構(gòu)類似手指狀，因此而得名。C2H2型鋅指在鋅離子存在時(shí)能夠緊密折疊形成ββα結(jié)構(gòu)，其中鋅離子夾疊在 α螺旋和 2股反向平行的 β折疊中。鋅指結(jié)構(gòu)既能與RNA和DNA結(jié)合，又能與DNA-RNA雙鏈分子以及同類蛋白結(jié)合[9]。

鋅指蛋白的DNA結(jié)合域具有與DNA雙螺旋互補(bǔ)的特殊表面結(jié)構(gòu)，依靠其指形結(jié)構(gòu)伸入到DNA雙螺旋的大溝內(nèi)，通過α螺旋中氨基酸的側(cè)鏈與DNA堿基以氫鍵特異性結(jié)合。鋅指與DNA發(fā)生結(jié)合時(shí)必須滿足如下條件：1) 鋅指蛋白的 α螺旋位于 DNA大溝內(nèi)；2) 鋅指蛋白攜帶正電荷的區(qū)域接近 DNA磷酸骨架；3) 鋅指間的接頭結(jié)構(gòu)相對固定[10]。與鋅指特異性結(jié)合相關(guān)的主要氨基酸位點(diǎn)是α螺旋上的第1、2、3、6位殘基 (圖1A)。每個鋅指單元能夠特異性地識別3 bp DNA序列。與其他DNA識別結(jié)構(gòu)域如亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域、αβα結(jié)構(gòu)域等不同的地方是鋅指結(jié)構(gòu)域能夠識別非對稱序列。因此，將一個或多個鋅指單元串聯(lián)并與轉(zhuǎn)錄激活或抑制域結(jié)合，可構(gòu)建以鋅指蛋白作為特異的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，稱之為人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Artificial zinc-finger protein transcription factor)。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合在啟動子周圍的特定區(qū)域內(nèi)，它們所連接的激活或者抑制域可以直接或者間接作用于RNA聚合酶，對后續(xù)的轉(zhuǎn)錄過程進(jìn)行調(diào)節(jié) (圖1B)。將這一類人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)，根據(jù)鋅指結(jié)構(gòu)域的識別序列，特異性地結(jié)合在啟動子區(qū)域，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄水平，通過定向篩選可獲得所需的表型。

2 微生物鋅指蛋白及其對細(xì)胞代謝的作用

存在于真核生物轉(zhuǎn)錄因子中的鋅指結(jié)構(gòu)域受到很多關(guān)注，但近年來在微生物轉(zhuǎn)錄因子、酶蛋白等重要的生物大分子中也發(fā)現(xiàn)了鋅指結(jié)構(gòu)域的存在，并證明這些蛋白在與 DNA、底物及金屬離子的識別過程中起著重要的作用。例如，在絲狀真菌中存在與胞內(nèi)代謝緊密相關(guān)的鋅指蛋白，包括黃曲霉Aspergillus flavus中與乙醇代謝相關(guān)的 C6型鋅指蛋白 AlcR，粗糙脈孢菌Neurospora crassa中參與糖代謝調(diào)節(jié)的Cre-1鋅指蛋白等[5-6]。植物病原性霉菌玉米黑粉菌Ustilago maydis中的Rual蛋白含有2個C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠調(diào)控黑粉菌酸 (Ustilagic acid)的生物合成。在碳源貧瘠的環(huán)境中，Rua1蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)域與黑粉菌酸合成基因簇的啟動子區(qū)中的保守序列結(jié)合，產(chǎn)生具有廣譜抗細(xì)菌抗真菌活性的糖脂，從而應(yīng)對環(huán)境壓力[13]。此外，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae中的Yml081W是C2H2型鋅指蛋白，能調(diào)節(jié)ALD4和ALD6基因的 mRNA水平，從而影響乙酸的合成[14]。Gis2、Mgs1鋅指蛋白也在釀酒酵母的 DNA的復(fù)制、修復(fù)及RNA加工等過程中發(fā)揮著重要的作用[15-16]。近期微生物中報(bào)道的部分鋅指蛋白及其功能如表1所示。

表1 部分微生物鋅指蛋白Table 1 Characterized zinc-finger proteins in microbial strains

首次在原核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的C2H2型鋅指蛋白是根癌農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens中的Ros蛋白[24]。Ros蛋白大小為 15.5 kDa，由A.tumefaciens中的染色體基因ros表達(dá)，能夠抑制致病基因和位于 Ti質(zhì)粒上致癌基因的轉(zhuǎn)錄。Ros蛋白含有一個鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地結(jié)合在致病基因上游大約9 bp的反向重復(fù)序列上 (稱為Ros box)。隨著蛋白中所含的鋅指單元數(shù)量的增加，會增強(qiáng)與靶基因識別的特異性和親和性。

在天藍(lán)鏈霉菌Streptomyces coelicolorA3(2)中，NrdR蛋白能夠抑制兩種核苷酸還原酶(RNRsI，II) 的表達(dá)。NrdR蛋白由大約 167個氨基酸組成，N端含有一個C4型鋅指結(jié)構(gòu)域與ATP錐域 (ATP cone domain)。當(dāng)ATP/dATP與ATP錐域結(jié)合時(shí)，能夠改變鋅指結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，使之與靶基因上游序列 (NrdR box) 特異性結(jié)合，調(diào)控目標(biāo)基因的表達(dá)[20]。這種鋅指單元與ATP錐域的組合系統(tǒng)能夠迅速地檢測胞內(nèi)物質(zhì)變化，靈活地調(diào)控基因表達(dá)量。

原核細(xì)胞中一些與代謝活動相關(guān)的酶與金屬硫蛋白中也含有鋅指結(jié)構(gòu)域，這些生物大分子通過鋅指結(jié)構(gòu)域與胞內(nèi)小分子物質(zhì)結(jié)合來調(diào)控胞內(nèi)代謝活動。在微生物的碳代謝物阻遏(Carbon catabolite repression, CCR) 過程中，葡萄糖激酶發(fā)揮著重要的作用?；疑溍咕鶶treptomyces griseus中的葡萄糖激酶SgGlkA屬于ROK葡糖激酶家族，SgGlkA含有兩段保守序列。其中一段含有由3個Cys結(jié)合一個鋅離子構(gòu)成的C3H型鋅指結(jié)構(gòu)域，它能夠與葡萄糖中C1、C2位的羥基形成氫鍵，在葡糖激酶識別底物的過程中起著重要的作用[21]。金屬硫蛋白普遍存在于許多真核細(xì)胞中，盡管在原核細(xì)胞中存在這種蛋白的報(bào)道較少，但大腸桿菌中和藍(lán)藻SynechococcusPCC 7942都存在SmtA類鋅離子結(jié)合金屬硫蛋白，每分子蛋白含有4個Cys組成鋅指結(jié)構(gòu)域，能夠結(jié)合一個鋅離子，大腸桿菌中的 SmtA類似蛋白更傾向于在氧化應(yīng)激環(huán)境下釋放鋅離子，從而改變大分子間的相互作用[7]。

蛋白激酶C (Protein kinase C, PKC) 在調(diào)控醇耐受性中起著重要的作用，PKC通過亞基C1A與C1B上的甘油二酯/佛波酯基識別乙醇分子，N端含有的鋅指結(jié)構(gòu)域與其他調(diào)控蛋白結(jié)合以抑制細(xì)胞代謝活動?；谶@一機(jī)理，我國學(xué)者利用PKC中識別乙醇分子的高度保守序列與丙酮丁醇梭菌Clostridium acetobutylicum蛋白組進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)氨基端序列相似度 30%以上并含有鋅指結(jié)構(gòu)域的Smb_G1518蛋白，并推測該蛋白與C. acetobutylicum的丁醇耐受性相關(guān)。通過敲除或抑制Smb_G1518基因，得到在1%丁醇濃度下生長速度加快，菌體終濃度 (A600)提高70%的突變菌株，從而證明了Smb_G1518蛋白的確與丁醇脅迫耐受相關(guān)[23]，這是首次關(guān)于梭菌中鋅指蛋白的報(bào)道。

3 人工鋅指蛋白技術(shù)及其在微生物代謝工程中的應(yīng)用

多種生物過程如發(fā)育、分化和疾病發(fā)生等都受細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)完成。為實(shí)現(xiàn)細(xì)胞代謝的定向調(diào)控，可使用人工設(shè)計(jì)的轉(zhuǎn)錄因子定向調(diào)控細(xì)胞內(nèi)相關(guān)靶基因的表達(dá)[11-12]。結(jié)合在特定基因啟動子區(qū)域的人工轉(zhuǎn)錄因子可以實(shí)現(xiàn)生物體內(nèi)靶基因的表達(dá)調(diào)節(jié)，并且可根據(jù)需要實(shí)現(xiàn)不同強(qiáng)度的微調(diào)節(jié)。人工轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)包括一個DNA結(jié)合域，一個轉(zhuǎn)錄調(diào)控域或效應(yīng)區(qū)。其中DNA結(jié)合域負(fù)責(zé)結(jié)合特定的基因上游序列，而效應(yīng)域可以實(shí)現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)不同靶基因的表達(dá)。因此可以設(shè)計(jì)DNA結(jié)合域和效應(yīng)區(qū)，創(chuàng)建所需要的人工轉(zhuǎn)錄因子。與其他DNA結(jié)合域相比，鋅指結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)上相對保守，與DNA作用相對簡單，識別 DNA序列具有高度特異性，能夠在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)節(jié)和控制基因表達(dá)。因此在人工轉(zhuǎn)錄因子的構(gòu)建中，鋅指結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是最合適的DNA結(jié)合域。

目前，人工鋅指蛋白技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多個領(lǐng)域，例如細(xì)胞分化、逆境抗性、表面抗原及新型藥物篩選[11-12]。人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子應(yīng)用范圍廣泛，包括哺乳動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母等真核細(xì)胞，以及細(xì)菌等原核細(xì)胞。第二，通過測定轉(zhuǎn)錄組的變化水平，能夠找到影響目標(biāo)基因表達(dá)水平的相關(guān)基因，從而進(jìn)一步針對性地研究。第三，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)不同，分別轉(zhuǎn)入同種細(xì)胞，能夠獲得不同的表型。例如溫度耐受性、滲透脅迫耐受性、溶劑耐受性等。第四，與傳統(tǒng)的過表達(dá)和敲除相比，人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子技術(shù)能夠在胞內(nèi)引起全局基因表達(dá)微小的變化，因此對細(xì)胞生長代謝影響較小，致死率低。下面將針對性地對人工鋅指蛋白技術(shù)在菌種改造中的應(yīng)用進(jìn)行介紹。

3.1 人工鋅指蛋白技術(shù)對酵母菌的代謝調(diào)控

當(dāng)控制性狀的基因未知或性狀受多基因控制時(shí)，利用人工鋅指蛋白文庫技術(shù)結(jié)合適當(dāng)?shù)暮Y選方法能夠獲得優(yōu)良性狀。韓國Jin-Soo Kim研究小組從人類基因組中克隆25種不同的鋅指單元的基因，以 4個為一組，構(gòu)建了 358種能夠識別 12 bp核苷酸序列的鋅指蛋白文庫。與Gal4轉(zhuǎn)錄激活功能域或Ume6抑制功能域結(jié)合，在半乳糖誘導(dǎo)型啟動子調(diào)控下在S. cerevisiae中表達(dá)，篩選得到酮康唑 (Ketoconazole) 抗性、耐熱性或具有滲透脅迫耐受性質(zhì)的酵母菌株[25]。與獲得突變菌株的傳統(tǒng)方法相比，人工鋅指蛋白技術(shù)更簡易，避免了繁重的多輪篩選。例如，隨機(jī)突變法至少需要107–109個單克隆，核酶文庫的多樣性要達(dá)到107，而人工鋅指蛋白文庫技術(shù)只需篩選105–106個轉(zhuǎn)化子[26]。除了改變內(nèi)源性基因的表達(dá)，人工鋅指蛋白還能夠調(diào)節(jié)外源性重組蛋白的表達(dá)量。Jin-soo Kim研究小組在釀酒酵母中異源表達(dá)人類生長激素 (hGH)，利用鋅指蛋白文庫篩選得到了 hGH產(chǎn)量提高 2.5倍的轉(zhuǎn)化菌株[26]。

人工鋅指蛋白可代替天然轉(zhuǎn)錄因子，對細(xì)胞代謝起到調(diào)控作用。利用酵母HIS3篩選系統(tǒng)從人工鋅指蛋白文庫中篩選得到能夠代替 Gal4轉(zhuǎn)錄因子的C2H2型人工鋅指蛋白。該實(shí)驗(yàn)中刪去了GAL1啟動子區(qū)域中Gal4轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合序列，將殘余啟動子序列作為鋅指結(jié)構(gòu)域的識別位點(diǎn)；文庫中的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域與Gal4轉(zhuǎn)錄因子激活域相連，在半乳糖篩選平板中得到了3株轉(zhuǎn)化菌株。Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3株轉(zhuǎn)化菌株中HIS3基因表達(dá)量提高了10倍，證明人工鋅指蛋白可有效激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[27]。

對人工鋅指蛋白在酵母菌代謝工程改造中的作用機(jī)理進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，人工鋅指蛋白技術(shù)改造后獲得的菌株性狀通常是多基因表達(dá)量共同變化的結(jié)果。將人工鋅指蛋白文庫轉(zhuǎn)入釀酒酵母生長缺陷型菌株S. cerevisiaesec14ts中表達(dá)，定向篩選得到生長缺陷表型消除的轉(zhuǎn)化子SG1、SG9 和 SG23[28]。已報(bào)道NET1、CSR1、PRD17、SFH5和PIK1基因轉(zhuǎn)錄量的上調(diào)或PCT1、CKI1和CPT1基因的下調(diào)能夠克服該生長缺陷表型。測定轉(zhuǎn)化子SG1和SG9中的轉(zhuǎn)錄組水平發(fā)現(xiàn)，上述基因均呈下調(diào)狀態(tài)。在轉(zhuǎn)化子SG9中過表達(dá)PCT1基因，只能部分恢復(fù)生長缺陷的表型；轉(zhuǎn)化子SG23中的NTE1基因的表達(dá)量呈上調(diào)，因此研究人員認(rèn)為該鋅指轉(zhuǎn)錄因子與NTE1基因的結(jié)合引起了表達(dá)量的上調(diào)，進(jìn)而利用ChIP-qPCR技術(shù)測定人工鋅指蛋白的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白并不與NTE1基因結(jié)合，而是通過與其他基因的結(jié)合，從而導(dǎo)致NTE1基因的表達(dá)量增多[28]。以上結(jié)果證明，鋅指蛋白對細(xì)胞代謝的調(diào)控在一般情況下是具有多基因全局調(diào)控能力的，相對于單基因的表達(dá)調(diào)控，利用人工鋅指蛋白可實(shí)現(xiàn)受多基因控制的復(fù)雜表型的調(diào)控。

人工鋅指蛋白在細(xì)胞內(nèi)的作用靶點(diǎn)，與預(yù)期的來源鋅指蛋白的保守結(jié)合位點(diǎn)可能有很大不同。在上述研究中獲得的鋅指蛋白轉(zhuǎn)化子SG1，胞內(nèi)含有的鋅指轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測能夠與12 bp序列特異性結(jié)合。在原始菌株基因組中發(fā)現(xiàn) 18個基因內(nèi)含有預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)，但是這些基因的轉(zhuǎn)錄水平均未見變化，說明無法通過預(yù)測的結(jié)合位點(diǎn)來表征基因的表達(dá)水平，但是正是這種低特異性造就了轉(zhuǎn)化子表型的多樣性。

本課題組近期與韓國學(xué)者合作，在釀酒酵母中轉(zhuǎn)入利用人工鋅指蛋白文庫，成功獲得了乙醇耐性和乙醇發(fā)酵性能改善的工業(yè)釀酒酵母[29]，顯示了人工鋅指蛋白可與釀酒酵母細(xì)胞內(nèi)的多種功能調(diào)控元件相結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞的代謝和生理功能。

3.2 人工鋅指蛋白技術(shù)對大腸桿菌的代謝調(diào)控

2000年麻省理工學(xué)院的研究學(xué)者證明了將鋅指蛋白與大腸桿菌RNA聚合酶的α亞基融合表達(dá)的蛋白能夠結(jié)合在報(bào)告基因上游并激活目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄[30]。這一發(fā)現(xiàn)首次證明了鋅指蛋白能夠在原核細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)控作用，從此開始了人工鋅指蛋白技術(shù)在原核菌種改造中的研究。將人類基因組來源的40種不同的鋅指單元組成三鋅指蛋白，與 cAMP repressor protein(CRP) 轉(zhuǎn)錄功能域融合表達(dá)，CRP為大腸桿菌環(huán)化腺嘌呤核苷酸受體蛋白，能夠調(diào)控大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)多于 200種不同啟動子的轉(zhuǎn)錄，三鋅指蛋白于CRP融合后構(gòu)成了人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子文庫，庫容6.4×104。將該文庫轉(zhuǎn)入E. coli中表達(dá)進(jìn)行表型篩選，獲得了熱激耐受性，滲透壓脅迫耐受性及抗低溫的轉(zhuǎn)化子[31]。此外該實(shí)驗(yàn)還研究了CRP功能域?qū)︿\指蛋白調(diào)控效果的影響，無CRP功能域的鋅指轉(zhuǎn)錄因子只能抑制目標(biāo)基因的表達(dá)，抑制效果為含有CRP功能域的轉(zhuǎn)錄因子的1/4；基于鋅指結(jié)構(gòu)域的識別位點(diǎn)不同，CRP功能域能夠產(chǎn)生不同的調(diào)控效果。當(dāng)識別位點(diǎn)位于核苷酸序列–80與–30之間時(shí)，該人工轉(zhuǎn)錄因子激活靶基因表達(dá)；當(dāng)識別位點(diǎn)位于–30下游時(shí)，抑制靶基因的表達(dá)。因此，人工鋅指蛋白連接的功能域在其發(fā)揮調(diào)控過程中起著重要作用。

利用通過人工鋅指蛋白技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)化子，可進(jìn)一步深入挖掘與菌株表型相關(guān)的基因。例如，獲得耐熱性大腸桿菌鋅指蛋白轉(zhuǎn)化子T9后，研究者利用免疫共沉淀方法找到與鋅指蛋白可能的結(jié)合序列并分析該基因的表達(dá)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，T9鋅指蛋白的結(jié)合抑制了ubiX基因的表達(dá)量；敲除ubiX基因后，轉(zhuǎn)化菌株仍保持耐熱性狀。因此推測，ubiX基因與大腸桿菌菌株耐熱性相關(guān)[32]。

目前，人工鋅指蛋白技術(shù)在原核微生物菌株改造中的應(yīng)用較少，主要集中于菌株對環(huán)境脅迫耐性方面的研究。近期韓國學(xué)者利用大腸桿菌人工鋅指蛋白文庫篩選出丁醇耐受性提高的轉(zhuǎn)化菌株 (丁醇耐受濃度從1%提高至1.5%)，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明sdhCDAB、flu和ybgD基因的轉(zhuǎn)錄水平急劇上調(diào)，其中sdhCDAB基因參與細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，已報(bào)道與細(xì)胞的丁醇脅迫耐受性相關(guān)。在野生型大腸桿菌中過表達(dá)以上 3個基因，菌株仍表現(xiàn)出較好的丁醇耐受性，證明基因sdhCDAB、flu和ybgD與菌株的丁醇耐受性相關(guān)。此外，丁醇耐受性菌株還表現(xiàn)出較好的溫度耐受性[33]。但該研究并未深入研究在耐性提高的突變體中人工鋅指蛋白與哪些靶點(diǎn)基因結(jié)合。

除了上述構(gòu)建人工鋅指轉(zhuǎn)錄因子與多個靶點(diǎn)基因的結(jié)合來通過細(xì)胞全局的代謝調(diào)控改造菌株性狀外，還可以利用鋅指結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合的特性，對菌株特定代謝物的生產(chǎn)進(jìn)行調(diào)控。韓國學(xué)者利用鋅指結(jié)構(gòu)域構(gòu)建DNA腳手架系統(tǒng)(DNA scaffold system) 以提高大腸桿菌中L-蘇氨酸的產(chǎn)量。將L-蘇氨酸合成途徑中的3種關(guān)鍵酶分別與識別不同DNA序列的3種鋅指蛋白融合表達(dá)，這些融合蛋白能特異性地識別腳手架質(zhì)粒 (Scaffold plasmid)，并按照一定順序排列在DNA腳手架上進(jìn)行酶促反應(yīng)。這一技術(shù)縮小了酶促反應(yīng)的作用空間，避免中間產(chǎn)物由于擴(kuò)散而造成的濃度降低或耗時(shí)長等問題。更重要的是，這一技術(shù)能夠通過簡單地改造腳手架質(zhì)粒來調(diào)整酶蛋白間距和作用角度，以及限速酶的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大腸桿菌的L-蘇氨酸生產(chǎn)時(shí)間縮短了50%，而且由于有害中間產(chǎn)物的迅速轉(zhuǎn)化，突變菌株的生長狀態(tài)更加良好[34]。

4 存在問題及展望

目前國內(nèi)學(xué)者利用人工鋅指蛋白技術(shù)主要進(jìn)行的是調(diào)控哺乳動物細(xì)胞的的基因表達(dá)及基因治療方面的研究，但在微生物代謝工程領(lǐng)域的應(yīng)用依然較少。盡管人工鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子在提高微生物菌種耐性的研究中得到廣泛應(yīng)用。但是目前還存在以下幾點(diǎn)有待探索：1) 對鋅指識別DNA、RNA及蛋白間相互作用的分子機(jī)制的研究，并在此基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出更有效的人工鋅指來調(diào)節(jié)不同微生物基因轉(zhuǎn)錄，優(yōu)化多酶催化體系；2) 目前該技術(shù)主要集中于提高菌株脅迫耐受性，例如高溫和丁醇耐受性。但是根據(jù)其調(diào)控基因表達(dá)量的機(jī)理，該技術(shù)有望應(yīng)用于提高目標(biāo)菌株的代謝產(chǎn)物，例如抗生素和酶等的生產(chǎn)；3) 目前用于構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子的鋅指結(jié)構(gòu)域主要是C2H2型鋅指，但是在原核微生物中目前發(fā)現(xiàn)的天然鋅指結(jié)構(gòu)域大多為C4和C6型。因此以多種鋅指類型為骨架，設(shè)計(jì)新型鋅指結(jié)構(gòu)域，有助于人工鋅指蛋白在原核菌株中的應(yīng)用；4) 目前鋅指蛋白技術(shù)主要應(yīng)用于酵母和大腸桿菌等菌株的改造，未來將有望應(yīng)用于梭菌、放線菌等其他具有工業(yè)生產(chǎn)價(jià)值的微生物菌株。

近年來，國內(nèi)外對微生物，尤其是原核微生物中鋅指蛋白的研究越來越多，鋅指蛋白作用機(jī)制的深入探究，將有助于理解鋅指蛋白對細(xì)胞代謝調(diào)控的分子機(jī)制。隨著微生物內(nèi)源鋅指蛋白調(diào)控機(jī)理的進(jìn)一步闡明，人工鋅指蛋白技術(shù)將具有更廣闊的應(yīng)用前景，成為對微生物進(jìn)行代謝工程改造的有力工具。

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