鋅指蛋白調(diào)控機體炎癥信號通路的研究進展

陳可添，黎力之，幸清鳳，廖曉鵬，關瑋琨，文龍，張海波*，郭冬生*

（1.宜春學院生命科學與資源環(huán)境學院，江西省高等學校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，宜春市功能農(nóng)業(yè)與生態(tài)環(huán)境重點實驗室，宜春學院繼續(xù)教育學院，江西宜春 336000；2.江西正宇生物科技有限公司，江西宜春 336000）

1985 年，Miller 等首次發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子IIIA 中鋅指結(jié)構(gòu)在基因調(diào)控方面起重要作用，并將含有鋅指結(jié)構(gòu)的蛋白命名為鋅指蛋白。鋅指蛋白基因敲除小鼠會逐漸出現(xiàn)惡病質(zhì)、自身免疫性疾病、不完全性脫毛、關節(jié)炎和結(jié)膜炎等病癥，鋅指蛋白基因全身性敲除小鼠在出生后呈現(xiàn)生長遲緩甚至異常死亡、代謝功能障礙和嚴重低血糖等病況。外源注射10 mk/kg葡萄糖酸鋅可顯著增強大鼠體內(nèi)鋅指蛋白基因表達，降低骨髓中性粒細胞和二甲基亞砜誘導分化人原髓白血病細胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子-（TNF-），增強機體免疫力。Wu 等研究發(fā)現(xiàn)，急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征（ALI/ARDS）大鼠補充外源鋅可上調(diào)鋅指蛋白表達，顯著降低TNF-、核因子-B（NFB）p65 的表達量，緩解脂多糖誘導的肺部炎癥反應。NF-B 信號通路與Wnt/-catenin 信號通路在調(diào)控炎癥反應過程中尤其關鍵，鋅指蛋白對兩者均有調(diào)節(jié)作用。其一，鋅指蛋白通過擾亂NF-B 抑制蛋白激酶（IKK）和NF-B 抑制蛋白（IB）磷酸化，抑制受體相互作用蛋白1（RIP1）泛素化過程，阻礙NF-B 活化，影響其下游炎癥通路；其二，鋅指蛋白通過抑制糖原合酶激酶-3（GSK-3）磷酸化、與散亂蛋白（Dvl）蛋白競爭性結(jié)合支架蛋白（Axin），穩(wěn)定-catenin 降解復合物完整性，調(diào)控炎癥通路。本文就鋅指蛋白介導動物機體炎癥相關通路的調(diào)節(jié)作用進行綜述，以期在調(diào)控動物炎癥方面提供理論參考。

1 鋅指蛋白簡述

1.1 鋅指蛋白概況 鋅指蛋白是一類具有指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，用鋅離子螯合劑除去鋅指蛋白中鋅離子或以Fe、Cu、Mn 等金屬離子置換，均會降低鋅指蛋白與DNA、RNA 等結(jié)合特異性，破壞蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。趙又佼等通過核磁共振發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白含鋅離子時會折疊成緊密結(jié)構(gòu)，鋅離子夾疊在螺旋和兩股反向平行的鏈之間；去除鋅離子后發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白肽呈無規(guī)則卷曲，鋅指序列無法正常形成，蛋白功能近乎完全喪失。鋅指結(jié)構(gòu)中有充分保守的區(qū)域，其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性主要由鋅離子提供的鏈間交叉連接維持，其缺乏時“鋅指”不能形成折疊結(jié)構(gòu)，鋅離子的存在使鋅指蛋白呈現(xiàn)一個由不同肽序列折疊而成的完美螺旋構(gòu)象。鋅指蛋白因序列結(jié)構(gòu)分不同構(gòu)型，具有特異功能，如痘病毒鋅指結(jié)構(gòu)域（POZ）、CXXC 型鋅指結(jié)構(gòu)域（ZF-CXXC）等，鋅指蛋白通過這些結(jié)構(gòu)域特異性識別結(jié)合底物，從而調(diào)控靶基因表達，影響機體生理功能。

1.2 鋅指蛋白分類 根據(jù)功能差異，鋅指蛋白分為RING 蛋白、去泛素分子（DUBs）蛋白、CXXC 蛋白、POZ 蛋白等多個亞家族。RING 鋅指蛋白具有進化上的保守性，與蛋白質(zhì)互作調(diào)控體內(nèi)靶基因表達。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)導通路相關蛋白和體內(nèi)部分調(diào)節(jié)蛋白如乳腺癌敏感因子、轉(zhuǎn)錄中間因子TIF1、原癌蛋白CBL 等都含有RING 鋅指區(qū)。DUBs 在泛素化途徑中扮演重要角色，其主要通過水解泛素羧基末端酯鍵、肽鍵或異肽鍵，將泛素分子特異性從鏈接泛素蛋白或前體蛋白中釋放。CXXC 鋅指蛋白家族特有基序ZF-CXXC，由兩對保守富含胞嘧啶集團結(jié)合2個鋅離子組成，可特異性識別并結(jié)合富含CpG 二核苷酸的DNA 序列。研究表明，人類基因5q31 染色體區(qū)缺失型鋅指蛋白基因易發(fā)生急性髓性白血病和骨髓增生異常綜合征等疾病，該家族內(nèi)如鋅指蛋白CXXC4、鋅指蛋白CXXC5除信號傳導、細胞凋亡、細胞能量代謝和血管生成等生物學功能外，還介導Wnt/-catenin 信號通路調(diào)控機體免疫。鋅指蛋白ZBTB 亞家族屬于POZ 蛋白家族，該亞家族成員N 端均有一個BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域，用以調(diào)節(jié)蛋白間相互作用；C 端數(shù)個CH鋅指結(jié)構(gòu)域，介導蛋白與DNA 序列間的識別、結(jié)合作用。該亞家族成員具有轉(zhuǎn)錄抑制功能，如鋅指蛋白ZBTB20 抑制產(chǎn)生Toll 樣受體4（TLR4）觸發(fā)的巨噬細胞前炎性細胞因子和干擾素（IFN-），調(diào)節(jié)機體免疫功能?？傊琑ING 蛋白、DUBs 蛋白、CXXC 蛋白、POZ 蛋白等鋅指蛋白亞家族本同末異，在NF-B、Wnt/-catenin 通路等途徑中調(diào)節(jié)機體免疫。

2 鋅指蛋白對動物炎癥通路的影響

2.1 鋅指蛋白對NF-B 通路的調(diào)節(jié)作用 正常生理條件下，NF-B 以一種無生理活性的二聚體形式存在于胞漿。當機體受到炎性細胞因子或其他外來刺激時，誘導胞質(zhì)內(nèi)IB 磷酸化、泛素化而降解，導致胞內(nèi)NF-B增多，誘使其下游炎性細胞因子合成釋放，機體發(fā)生炎癥反應、細胞凋亡等組織損傷現(xiàn)象。鋅指蛋白A20是炎性反應的內(nèi)源性調(diào)控蛋白和組織細胞保護性蛋白，在B 細胞、T 細胞和成纖維細胞中均表達，對NF-B負性調(diào)控功能體現(xiàn)在減輕機體炎癥反應及緩解免疫損傷方面。鋅指蛋白A20 作為DUBs 家族中的一員，其N 端含有半胱氨酸蛋白酶/DUB 結(jié)構(gòu)域OUT，C 端含有7個鋅指結(jié)構(gòu)，其中第4 鋅指有E3 泛素連接酶活性，具有去泛素化和泛素化活性的雙重功能。一方面，鋅指蛋白A20 通過N-末端脫泛素因子干擾腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）、RIP1、NF-B 必需調(diào)制蛋白（NEMO）等泛素化修飾，抑制下游IB 磷酸化；另一方面，鋅指域C-末端E3 泛素連接酶泛素化修飾TLR、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（NOD2）、T 細胞抗原受體（TCR）和B 細胞抗原受體（BCR），抑制NF-B 信號通路。

隨著研究的深入，現(xiàn)已確定凡能激活NF-B 信號通路的因素均能誘導鋅指蛋白A20 表達上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)10 ng/mL TNF-處理大鼠髓核細胞72 h 后，鋅指蛋白A20、p53、p-p65 等表達均顯著提升。急性肝損傷模型小鼠血清和肝組織中TNF-表達較正常組小鼠升高，肝組織白細胞介素1（）、mRNA表達及p-IB和p-NF-B p65 蛋白表達均增加；外源藥物增強鋅指蛋白基因表達后發(fā)現(xiàn)小鼠血清和肝組織TNF-濃度降低，肝組織NF-B p65 蛋白升高，mRNA 及p-IB和p-NF-B p65蛋白表達顯著降低。TNF-與受體TNFR2 結(jié)合后使其匯集，泛素化RIP1 的K63 位，激活轉(zhuǎn)化生長因子激酶并與IKK-結(jié)合形成復合體，IB發(fā)生泛素化，引起NF-B 進入細胞核，激活下游靶基因。上調(diào)鋅指蛋白表達可抑制NF-B 信號通路，調(diào)控炎癥反應。試驗發(fā)現(xiàn)，在TNF 激活的NF-B 信號通路中，鋅指蛋白A20、多聚泛素化鏈和NEMO 形成復合物，利用鋅指蛋白A20 去泛素化功能限制IKK 活化，以及鋅指結(jié)構(gòu)域7（ZnF7）與K63 多聚泛素化鏈結(jié)合共同作用使RIP1 被蛋白酶降解；同時，鋅指蛋白A20 還可使TRAF2 泛素化降解，抑制NF-B 信號活化。鋅指蛋白A20 還可阻礙NF-B 作用于IL-1、CD40 的反應，抑制模式識別受體發(fā)出的信號及T 細胞、B 細胞抗原受體活化。鋅指蛋白ZBTB20，又稱ZNF288、DPZF或HOF，是BTB/POZ 家族的獨特成員，主要通過N端BTB/POZ 結(jié)構(gòu)域和C 端CH保守的Krüppel 型鋅指作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用，在機體脾臟、胸腺、淋巴結(jié)等組織器官廣泛表達。Liu 等特異性敲除小鼠髓系細胞鋅指蛋白基因，發(fā)現(xiàn)多種TLR 配體反應性下降，巨噬細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子如TNF、IFN-、IL-6 等減少。另外，鋅指蛋白ZBTB20 通過抑制TLR 下游信號通路中基因轉(zhuǎn)錄，下調(diào)NF-B表達。綜上所述，鋅指蛋白對機體NF-B 的調(diào)控機理主要通過下調(diào)基因表達，干擾IB 磷酸化，抑制NF-B 活化，減少促炎因子分泌，平衡機體炎癥反應（圖1）。

圖1 鋅指蛋白介導NF-кB 信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)動物腸道炎癥

2.2 鋅指蛋白對Wnt/-catenin 信號通路的影響 Wnt/-catenin 信號通路具有進化保守、高度復雜的特點，由配體蛋白Wnt 和膜蛋白受體結(jié)合激發(fā)信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)器官發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)及損傷修復等重要過程。外界刺激（如損傷、病原體、激動劑等）使Wnt 信號通路異常，抑制GSK-3活性，導致細胞內(nèi)-catenin 聚集過多，與T 細胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）相互作用，引起機體過度炎癥反應。如發(fā)生骨關節(jié)炎時，Wnt/-catenin 信號通路過表達抑制軟骨細胞增殖及II型膠原蛋白分泌導致軟骨退化，另外還使滑膜成纖維細胞過度增殖，及I 型膠原沉積引起滑膜炎癥。多發(fā)性硬化（中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘性病變）大鼠模型體內(nèi)Wnt3、p-GSK-3、-catenin 蛋白水平顯著升高，模型鼠脊髓呈現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，TNF-、IL-1等炎癥因子濃度升高。

鋅指蛋白CXXC 家族調(diào)控Wnt/-catenin 信號通路，一是當機體處于穩(wěn)定狀態(tài)時，通過降低GSK-3磷酸化，使-catenin 降解保持低值；同時，鋅指蛋白CXXC 過表達抑制Wnt/-catenin 信號通路關鍵蛋白，競爭性拮抗使-catenin 降解復合物免受破壞。在Wnt 配體未激活信號通路時，Axin、腺瘤樣息肉蛋白（APC）、GSK-3和酪蛋白激酶（CK I）組成復合體，使-catenin 磷酸化后被-轉(zhuǎn)導素重復序列包含蛋白泛素化降解。對膠原蛋白II 誘導的類風濕關節(jié)炎大鼠注射GSK-3抑制劑后發(fā)現(xiàn)，前列腺素E2,5-羥色胺和組胺等自身活性物質(zhì)增加，血清中IL-6、IL-12 和TNF-等細胞炎性因子顯著增多。Giacoppo 等建立實驗性變態(tài)反應性腦脊髓炎小鼠模型發(fā)現(xiàn)，GSK3-活性受到抑制，-catenin上調(diào)，入核后調(diào)節(jié)下游基因表達。正常狀態(tài)下鋅指蛋白CXXC4 對GSK-3有保護作用，可抑制GSK-3的磷酸化。李萍等研究發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白基因甲基化異常的細胞組中p-GSK-3、Wnt、-catenin 相對量均顯著高于正常組，表明當鋅指蛋白CXXC4 基因被抑制時，GSK-3磷酸化加劇，Wnt/-catenin 通路上調(diào)。

當機體發(fā)生炎癥反應或受到外界刺激時，Wnt 配體蛋白與卷曲蛋白（FZD）、低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合，形成Wnt-FZD-LRP5/6 三聚體復合物，使細胞內(nèi)Dvl 蛋白活化并向質(zhì)膜遷移。研究表明，鋅指蛋白CXXC4、CXXC5 能作為Dvl 蛋白結(jié)合伴侶，負反饋調(diào)節(jié)Wnt/-catenin 信號通路。鋅指蛋白CXXC4 通過其特殊的“KTXXXI”基序直接與Dvl 蛋白PDZ 結(jié)構(gòu)域相互作用，穩(wěn)定-catenin 降解復合物。鋅指蛋白CXXC5 與Dvl 蛋白相互作用在多種細胞內(nèi)被發(fā)現(xiàn)，如成骨細胞、皮膚細胞、神經(jīng)干細胞等。Lee 等在皮膚損傷后修復愈合的研究中發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白CXXC5 含有C-末端的Dvl 結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其與Dvl 相互作用，成為Wnt/-catenin 途徑的負反饋調(diào)節(jié)因子。對生長期小鼠肺成纖維細胞分別添加目的基因腺病毒載體、基因抑制載體感染48 h后發(fā)現(xiàn)，添加組-catenin、Dvl 蛋白量顯著減少，抑制組-catenin、Dvl 蛋白表達量顯著增加；此外，在TGF-1 刺激下細胞-catenin、Dvl 蛋白表達增加，添加基因載體后，兩者逐漸減少。表明鋅指蛋白CXXC5 在活化的Wnt/-catenin 信號通路中，過表達影響Dvl 蛋白含量調(diào)控-catenin 濃度。綜上所述，當Wnt/-catenin 信號通路無Wnt 配體存在時，鋅指蛋白通過抑制GSK-3磷酸化，穩(wěn)定-catenin 降解復合物，抑制下游IL-1、TNF-等炎癥因子分泌；當Wnt 配體激活Wnt/-catenin 信號通路，鋅指蛋白與Dvl 蛋白進行競爭性結(jié)合，阻礙Dvl 蛋白與Axin-GSK-3作用，間接穩(wěn)定-catenin 降解復合物，阻斷炎癥過度進程（圖2）。

圖2 鋅指蛋白介導Wnt/β-catenin 信號轉(zhuǎn)導通路調(diào)節(jié)動物炎癥

3 總結(jié)與展望

在基因炎癥通路中，鋅指蛋白可以調(diào)控基因表達，干擾IB磷酸化，抑制NF-B 信號通路，減少炎癥因子分泌。在Wnt/-catenin 信號通路中，鋅指蛋白會抑制GSK-3磷酸化，保持-catenin 降解復合物完整性；另外，鋅指蛋白還會與Dvl 蛋白競爭，保護Axin 蛋白，調(diào)控Wnt/-catenin 通路，抑制炎癥反應。目前對鋅指類蛋白的研究主要集中在分析鋅指蛋白結(jié)構(gòu)，建立其與DNA 互作模型。但是關于鋅指蛋白的研究仍存在不足。第一，鋅指蛋白家族龐大種類較多，除對C2H2 型研究較透徹外，其他各類型的結(jié)構(gòu)功能有待深入探索。第二，鋅指蛋白功能研究大多集中在機體免疫炎癥抗腫瘤等方面，在應對一些非生物脅迫如熱應激等環(huán)境下相關研究較少。隨著對鋅指蛋白結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，闡明鋅指蛋白調(diào)控機理，人工鋅指蛋白技術(shù)將具有更廣闊的應用前景。