苯基硫醚的合成及其衍生化性能＊

李迎紅，管向明，宋丹青

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京 100050;2.美國南達(dá)科他州立大學(xué)藥學(xué)系，南達(dá)科他州布魯金斯 57007)

巰基化合物在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)［1］及維持機(jī)體氧化還原穩(wěn)態(tài)［2～3］等方面發(fā)揮著重要作用。長期以來，巰基/二硫鍵水平一直被作為衡量體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的重要指標(biāo)［4～5］。人們一直致力于尋找合適的巰基衍生化方法對(duì)其進(jìn)行含量分析［6～8］，其中，monobromobimane［9］，7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole-4-sulfonate(SBD-F)以及4-aminosulfonyl-7-fluoro-2，1，3-benzoxadiazole(ABDF)因具有良好的透膜性和高度的巰基反應(yīng)性和選擇性而備受關(guān)注［10～12］。但是，這些親電性試劑都不是巰基專一性的，除了巰基外，它們還能與其它親核性基團(tuán)，如-OH，-CO2H和-NH2反應(yīng)，極大地限制了其應(yīng)用［13～14］。

除了通過基因工程引入適當(dāng)熒光性蛋白的方法［15］外，目前二硫醚是唯一公認(rèn)的能與巰基專一性反應(yīng)的結(jié)構(gòu)類型，其中應(yīng)用最廣泛的是埃爾曼試劑［5'，5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)］，其特異性原理在于巰基特異性的巰基-二硫鍵置換反應(yīng)［16］。類似原理的小分子巰基專一性試劑還有n-octyldithionitrobenzoic acid(OTNB)［17］，4，4'-dithiodipyridine(4-DTDP)［18］等。2006 年，Pullela 等［14］將這一原理應(yīng)用于大分子所制備的大分子二硫醚化合物同樣具有巰基專一性。但是，這些小分子二硫醚化合物普遍存在極性過大透膜性低的問題，而大分子二硫醚化合物與巰基的反應(yīng)性又過低［14］。到目前為止，在二硫醚化合物中還未能發(fā)現(xiàn)能夠用于生物體內(nèi)巰基定量分析的理想試劑。

在前期尋找?guī)€基特異性標(biāo)記試劑的研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)并證明了一類全新結(jié)構(gòu)的化合物——苯并-2，1，3-噁二唑硫醚，能夠特異性的快速的與巰基反應(yīng)，而且也表現(xiàn)出良好的膜透性［19］，顯示出其在生物體內(nèi)巰基定量分析的潛在應(yīng)用前景。這一結(jié)果提示我們，芳香硫醚很有可能是巰基專一性反應(yīng)試劑的一類新的結(jié)構(gòu)骨架。

在該類硫醚化合物中，苯環(huán)上的2，1，3-噁二唑，硝基以及砜基均為強(qiáng)吸電子基團(tuán)。由此我們推測，二苯基硫醚結(jié)構(gòu)是巰基專一性反應(yīng)的決定性結(jié)構(gòu)單元，而苯環(huán)上吸電子基團(tuán)的引入實(shí)則加速了其與巰基的反應(yīng)。因此，本文設(shè)計(jì)并合成了結(jié)構(gòu)更為簡化的2，4-二硝基苯基硫醚(2a)和對(duì)硝基硫醚(2b，Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。通過考察2a或2b與巰基代表化合物NAC(N-乙酰基半胱氨酸)的反應(yīng)以探討不同吸電子基團(tuán)對(duì)反應(yīng)活性的影響，以及與親核性代表化合物色氨酸的反應(yīng)，來探索其對(duì)巰基基團(tuán)的反應(yīng)專一性。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CXM-300型精密熔點(diǎn)儀(溫度未經(jīng)校正);ZF-1型三用紫外分析儀;Varian Inova 400型和Bruker AvanceⅢ400型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Orbitrap型液質(zhì)聯(lián)用儀;Agilent 1 260型高效液相色譜儀［HPLC，Waters ODS C18 反相柱(4.6 m ×150 mm，5 μm)，柱溫 25℃，檢測波長254 nm;流動(dòng)相，0.1%H3PO4水溶液(A)和乙腈(B);洗脫梯度Q=V(B)∶V(A)=40∶60，0 min～2 min;Q=40 ∶60～80 ∶20，2 min～12 min;Q=80 ∶20，12 min～18 min;Q=80 ∶20 ～40 ∶60，18 min ～18.1 min;Q=40 ∶60，18.1 min ～23 min;流速0.8 mL·min-1］;CombiflashRf 200型Flash柱。

預(yù)鋪硅膠鋁箔卷，Merck 公司;0.5 mol·L-1Tris緩沖液，pH 8.0，2.0 mmol·L-1EDTA;其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)2a的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在三口瓶依次加入乙腈30 mL和1a 2.16 g(10 mmol)，攪拌使其完全溶解;滴加NaSH 0.28 g(5.0 mmol)的 0.5 mol·L-1Tris緩沖溶液30 mL，滴畢，于70℃反應(yīng)1 h(TLC跟蹤)。減壓濃縮，殘余物經(jīng)Flash柱純化得黃色固體2a 1.56 g，收率85.2%，m.p.192 ℃ ～193 ℃;1H NMR δ:8.97(d，J=2.3 Hz，1H)，8.5(dd，J=2.4 Hz，8.8 Hz，1H)，7.8(d，J=8.8 Hz，1H);13C NMR δ:149.2，147.4，138.0，135.7，128.5，121.5(與文獻(xiàn)［20］數(shù)據(jù)一致)。

用類似方法合成2b(反應(yīng)時(shí)間8 h)1.45 g，收率 87.6%，m.p.159 ℃ ～160 ℃;1H NMR δ:8.24(d，J=8.7 Hz，1H)，7.64(d，J=8.7 Hz，1H);13C NMR δ:146.61，143.46，141.94，131.15，126.60，124.67(與文獻(xiàn)［21］數(shù)據(jù)一致)。

(2)3a的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在反應(yīng)瓶中依次加入2a 0.37 g(1.0 mmol)，乙腈 20 mL 和 NAC 0.30 g(2.0 mmol)的0.5 mol·L-1Tris緩沖溶液20 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)過夜(TLC跟蹤)。減壓濃縮除去溶劑，殘余物經(jīng)Flash柱純化得3a 0.18 g，收率54.7%;1H NMR δ:8.9(d，J=2.40 Hz，1H)，8.4(dd，J=2.4 Hz，9.0 Hz，1H)，8.4(d，J=7.7 Hz，1H)，7.80(d，J=9.1 Hz，1H)，4.50(td，J=7.9 Hz，4.6 Hz，1H)，3.64(dd，J=13.1 Hz，4.6 Hz，1H)，3.40(dd，J=13.0 Hz，8.3 Hz，1H);13C NMR δ:171.9，170.0，145.6(2C)，145.3，144.2，128.8，127.9，51.4，34.5，22.8;HR-ESI-MSm/z:Calcd for C11H11O7N3S{［M -H］-}328.023 43，found 328.023 40。

用類似方法合成3b(于80℃反應(yīng)12 h)0.20 g，收率 35.2%;1H NMR δ:8.4(d，J=7.9 Hz，1H)，8.2(d，J=8.8 Hz，1H)，7.6(d，J=8.8 Hz，1H)，4.5(td，J=8.0 Hz，5.0 Hz，1H)，3.6(dd，J=13.5 Hz，4.8 Hz，1H)，3.4(dd，J=13.5，8.3 Hz，1H)，1.86(s，3H);13C NMR δ:172.0，169.7，147.2，144.7，126.6(2C)，124.0(2C)，51.8，33.2，22.5;HR-ESI-MSm/z:Calcd for C11H12O5N2S{［M - H］-}238.038 64，found 238.038 32。

1.3 巰基反應(yīng)性考察

在反應(yīng)瓶中加入等體積的1 mmol·L-12a(或2b)的乙腈溶液和 2 mmol·L-1NAC 的 0.5 mol·L-1Tris緩沖液，攪拌使其混合均勻，反應(yīng)至0.5 h和4.0 h分別取反應(yīng)液用HPLC檢測。

1.4 巰基反應(yīng)專一性考察

在反應(yīng)瓶中加入等體積的1 mmol·L-12a(或2b)的乙腈溶液和含50 mmol·L-1色氨酸的0.5 mol·L-1Tris緩沖液，分別于室溫和60 ℃下攪拌混合均勻，于12 h取反應(yīng)液用于HPLC檢測。

2 結(jié)果與討論

由于巰基極易被氧化，因此硫醚2a和2b及其NAC衍生物3a和3b的合成均需在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。所用的質(zhì)子性溶劑均為弱堿性的Tris緩沖液，以使巰基能始終以負(fù)離子形式存在，增強(qiáng)其反應(yīng)性，加快反應(yīng)速度。EDTA的作用在于絡(luò)合溶劑中可能存在的各種金屬離子，從而保護(hù)巰基不被氧化［22］。

硫醚2a表現(xiàn)出良好的巰基反應(yīng)性。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，4 h時(shí)NAC已將2a完全定向轉(zhuǎn)化NAC衍生物3a(保留時(shí)間為7.451 min)。NAC與2b在此條件下基本不反應(yīng)，相應(yīng)的NAC衍生物3b在長時(shí)間加熱條件(80℃，12 h)下才能生成。該結(jié)果表明二苯基硫醚苯環(huán)上的電子云密度明顯影響反應(yīng)活性，相比之下，2，4-二硝基取代使之更易于與巰基發(fā)生發(fā)應(yīng)。

由于色氨酸中含有-OH，-CO2H和-NH2三種常見親核基團(tuán)，是考察硫醚化合物巰基專一性的理想受試物。在色氨酸50倍過量時(shí)，無論是室溫還是加熱條件下，2a都能保持穩(wěn)定12 h以上。而在室溫條件下，只需要1倍過量的NAC即可將2a 100%轉(zhuǎn)化，這表明了2a與巰基反應(yīng)的專一性。2a對(duì)NAC的反應(yīng)性明顯高于2b;2a對(duì)-OH，-CO2H和-NH2均表現(xiàn)出明顯的化學(xué)惰性。

綜上所述，二苯基硫醚是一類巰基專一性反應(yīng)試劑，苯環(huán)上適當(dāng)?shù)奈娮踊鶊F(tuán)可優(yōu)化其與巰基的反應(yīng)活性。本研究結(jié)果為巰基專一性反應(yīng)試劑增加了一個(gè)新的結(jié)構(gòu)類型，為巰基標(biāo)記試劑的設(shè)計(jì)提供一種新的設(shè)計(jì)思路。

致謝:感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所測定核磁共振數(shù)據(jù)，感謝中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所分析測試中心測定ESI高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

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