人卵泡抑素基因短發(fā)夾RNA 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及其干擾效果的初步鑒定

莫 毅 梁方方 陳月鳳 江如蘭 葉 健 謝丹尼

1.廣西壯族自治區(qū)人口和計(jì)劃生育研究中心(南寧，530021);2.廣西壯族自治區(qū)畜牧研究所;3.廣西壯族自治區(qū)醫(yī)科大學(xué)研究生院

卵泡抑素是20世紀(jì)80年代中期發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族(TGF-β)的重要成員，作為卵泡刺激素(FSH)的抑制蛋白，具有抑制垂體促性腺激素的功能［1～3］;通過(guò)抑制素(INH)- 激活素(ACT)- 卵泡抑素(FS)調(diào)控系統(tǒng)［4，5］，參與卵巢顆粒細(xì)胞分化、黃體形成、卵泡閉鎖，胚胎發(fā)育及胎盤功能等多方面調(diào)節(jié)［6～9］，在生殖醫(yī)學(xué)中的作用正越來(lái)越受到人們的重視。本實(shí)驗(yàn)以人FS為靶基因，構(gòu)建了FS的短發(fā)夾RNA(shRNA)重組質(zhì)粒，并體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至卵巢癌細(xì)胞系，以確定其對(duì)FS基因干擾效果，為進(jìn)一步研究FS基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄酶 M-MLV、Oligo dT-18和脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen，美國(guó) );DNA聚合酶(Taq)、dNTPs、T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶AgeⅠ、EcoRⅠ和NcoⅠ(Takara，日本);DNA純化試劑盒和質(zhì)粒小量提取試劑盒(TIANGEN，中國(guó));DMEM高糖培養(yǎng)液(杭州吉諾，中國(guó));胎牛血清(杭州四季青，中國(guó));1 kb DNA ladder(北京全式金，中國(guó));DH 5a感受態(tài)細(xì)胞為本研究中心基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室保存;pLKO.1載體(北京前景科創(chuàng)生物技術(shù)有限公司，中國(guó));3AO人卵巢癌細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞生物研究所。引物序列由上海生工生物科技有限責(zé)任公司合成。

1.2 方法［10］

1.2.1 靶向FS基因的shRNA設(shè)計(jì) 利用Ambion網(wǎng)站上siRNA設(shè)計(jì)軟件，以GenBank中人FS cDNA序列(NM_006350)為靶序列;結(jié)合FS mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)及小分子干擾RNA設(shè)計(jì)原則，并應(yīng)用BLAST檢索排除其他基因的同源序列;遵循shRNA表達(dá)質(zhì)粒pLKO.1酶切位點(diǎn)要求，設(shè)計(jì)FS shRNA的引物序列。所選用引物正義鏈為:5＇- CGGGCTGGGCAGATCTATTGGATTCTCGAGAATCCAATAGAT CTGCCCAGCTTTTTG-3＇，反義鏈為:5＇-AATTCAAAAAGCTGGGCAGATCTATTGGATTCTCGAGA ATCCAATAGATCTGCCCAGC-3＇。

1.2.2 pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將引物稀釋后配置退火反應(yīng)體系如下:稀釋的正反引物各 5.0μl、10 × Oligo退火緩沖液 2.0μl、ddH2O 8.0 μl、總體積 20.0μl。PTC 200(MJ，美國(guó))儀器中退火處理:95℃，5min;70℃，10min。取出反應(yīng)管，放入70℃水浴鍋(關(guān)掉水浴鍋)使之自然冷卻至室溫。微型離心機(jī)瞬時(shí)離心，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

pLKO.1載體使用AgeⅠ與EcoRⅠ進(jìn)行線性化酶切后，使用DNA純化試劑盒回收線性化載體。然后，將雙鏈Oligos退火聚合物與純化的線性化pLKO.1載體按照3∶1比例混合，加入T4 DNA連接酶16℃連接過(guò)夜，構(gòu)建成pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒。次日轉(zhuǎn)化DH 5a感受態(tài)細(xì)菌，涂于含有氨芐青霉素的培養(yǎng)板中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，第三日挑取3個(gè)單克隆菌落搖菌擴(kuò)增。

1.2.3 重組質(zhì)粒的鑒定 過(guò)夜培養(yǎng)的菌液使用質(zhì)粒小量提取試劑盒抽提質(zhì)粒，并通過(guò)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ與EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定;酶切驗(yàn)證后的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序鑒定。

1.2.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3AO人卵巢癌細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前1天將3AO細(xì)胞接種到6cm培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒。采用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，按試劑說(shuō)明書(shū)將 pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人3AO卵巢癌細(xì)胞，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的3AO細(xì)胞為對(duì)照。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR初步鑒定重組質(zhì)粒干擾效果 轉(zhuǎn)染24h后分別收集各組細(xì)胞，按Trizol操作說(shuō)明提取各組細(xì)胞總RNA，并使用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和Oligo dT-18引物逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。通過(guò)引物設(shè)計(jì)軟件Premier 5.0選擇FS及內(nèi)參β-actin定量引物，并由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。FS正向引物序列:5＇-GTGACAATGCCACTTATGCC-3＇;反向引物序列:5＇-GCTGTAGTCCTGGTCTTCATCT-3＇。β-actin引物序列:正向引物:5＇-TGGCACCACACCTTCTACAAT-3＇;反向引物:5＇-AGAGGCGTACAGGGATAGCAC-3＇。引物加入實(shí)時(shí)定量PCR預(yù)混反應(yīng)體系(SsoFast EvaGreen supermix，Bio-Rad公司，美國(guó))后，退火溫度為60℃，40個(gè)循環(huán)反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后數(shù)據(jù)通過(guò)Bio-Rad CFX Manager 2.0軟件內(nèi)的Gene Expression分析模塊將兩組目的基因和內(nèi)對(duì)照基因表達(dá)情況進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定

使用NcoⅠ和EcoRⅠ對(duì)單克隆菌落抽提的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，可得到兩個(gè)條帶，分子量分別約為2 000bp和5 000bp，與預(yù)計(jì)值相符(圖1)。將3個(gè)經(jīng)酶切鑒定的陽(yáng)性克隆送測(cè)序，測(cè)序結(jié)果證實(shí)設(shè)計(jì)序列正確插入載體且無(wú)突變。

2.2 重組質(zhì)粒對(duì)FS mRNA干擾效果的初步鑒定

通過(guò)實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR測(cè)定FS mRNA水平，結(jié)果顯示經(jīng)shRNA干擾后，干擾組細(xì)胞中FS基因mRNA表達(dá)水平較未轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞明顯下降，兩組目的基因相對(duì)于內(nèi)對(duì)照的表達(dá)量分別為0.41和1.00，本次設(shè)計(jì)克隆的FS的shRNA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)FS mRNA的干擾效率為59%(圖2)。

圖1 pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3AO細(xì)胞后FS mRNA的表達(dá)

3 討論

卵巢中FS可通過(guò)INH-ACT-FS系統(tǒng)內(nèi)分泌機(jī)制調(diào)節(jié)垂體FSH的分泌，并且通過(guò)旁分泌與自分泌的機(jī)制影響卵巢功能、調(diào)節(jié)卵泡的發(fā)育、閉鎖和黃體化過(guò)程，進(jìn)而影響女性生殖功能。INH-ACTFS系統(tǒng)異常所致的卵泡膜細(xì)胞和顆粒細(xì)胞功能失常直接導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟障礙［11］。在人類輔助生育技術(shù)應(yīng)用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，異常高的FS可過(guò)度抑制刺激卵泡顆粒細(xì)胞增殖分化的FSH合成和分泌，影響卵細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致排卵障礙，造成女性不孕［4，9］;血清中過(guò)高的FS水平將影響輔助生殖技術(shù)過(guò)程中外源激素的促排卵作用，并與女性多囊卵巢綜合征(PCOS)密切相關(guān)［12］。

RNA干擾(RNAi)是由雙鏈RNA引發(fā)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，具有快速、有效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已成功用于特定基因的功能研究。而shRNA更是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種抑制特定基因表達(dá)的新方法，與直接導(dǎo)入siRNA和體外轉(zhuǎn)錄的siRNA相比，shRNA表達(dá)載體易于擴(kuò)增，制備成本低;易于通過(guò)抗性選擇標(biāo)記構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系;便于觀察長(zhǎng)期抑制特定基因的效果;極低濃度的shRNA就可以引發(fā)強(qiáng)大的RNA干擾效應(yīng)。本文使用pLKO.1慢病毒載體質(zhì)粒構(gòu)建了pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒，測(cè)序證實(shí)插入片段序列符合設(shè)計(jì)要求;并使用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR證實(shí)pLKO.1-FS-shRNA重組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入3AO人卵巢癌細(xì)胞后可有效干擾3AO細(xì)胞內(nèi)FS基因的表達(dá)，干擾效率達(dá)59%。此結(jié)果為進(jìn)一步利用構(gòu)建穩(wěn)定抑制FS表達(dá)的細(xì)胞系，深入研究FS對(duì)于預(yù)測(cè)卵巢儲(chǔ)備功能和人類輔助生育技術(shù)應(yīng)用結(jié)局具有重要意義。

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