尼氟滅酸和鈣通道阻斷劑對(duì)γ-氨基丁酸激活電流去敏感的作用*

李 麗，汪 洋，馬克濤，成洪聚，趙 磊，司軍強(qiáng)△

（1.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理和病理生理教研室，2.新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-電生理研究室，新疆石河子832002）

γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）作為一種重要的中樞抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有普遍的抑制性作用。GABA在抗焦慮、抗驚厥、鎮(zhèn)痛和調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等方面發(fā)揮著重要作用［1］。GABA激活的受體分為三類，包括 GABAA、GABAB和 GAGAC，其中GABAA和GABAC屬超家族配體門控離子通道受體，GABAB屬G蛋白偶聯(lián)受體。目前認(rèn)為GABAA受體包括氯通道和五個(gè)分別供GABA、苯二氮類（benzodiazepine）、巴比妥類（barbiturates）、苦味毒（picrotoxin）及麻醉藥作用的結(jié)合位點(diǎn)［2］，上述藥物可通過與其相應(yīng)部位的結(jié)合調(diào)節(jié)GABAA受體對(duì)GABA的反應(yīng)。GABAA受體已有至少19個(gè)受體亞單位被成功克隆，已鑒定的GABAA受體主要由α、β、γ和δ構(gòu)成，其中除δ亞基外，每一種亞基均有不同的異構(gòu)體存在（α1-α6、β1-β4和γ1-γ4），α6和γ2又各有兩個(gè)剪接變異體。目前認(rèn)為GABAA受體是由不同亞基構(gòu)成的五聚體，被GABA激活后通過開啟Cl-通道產(chǎn)生抑制作用，其效應(yīng)可被荷包牡丹堿（bicuculline）阻斷。GABAA受體本身作為通道-受體復(fù)合體還有多種藥物的結(jié)合位點(diǎn)，這些藥物結(jié)合位點(diǎn)與GABA識(shí)別位點(diǎn)在構(gòu)像上相互作用，直接或間接參與Cl-通道的門控過程，發(fā)揮著加強(qiáng)或抑制GABA的藥理學(xué)作用。

非甾體類抗炎藥物（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）是目前臨床使用較為廣泛的一類藥物，其通過抑制環(huán)氧合酶和前列腺素的合成發(fā)揮解熱、鎮(zhèn)痛和抗炎作用［3］。已有文獻(xiàn)報(bào)道，NSAIDs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元GABAA受體功能也存在著重要的調(diào)節(jié)作用［4］，我們前期的研究也發(fā)現(xiàn)NSAIDs對(duì)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglia，DRG）神經(jīng)元 GABAA受體的激活電流有明顯的抑制作用，這一作用我們推測(cè)可能是通過抑制鈣激活的氯離子通道（calciumactivated chloride channels，CaCC）實(shí)現(xiàn)的，事實(shí)是否如此還需進(jìn)一步深入研究。本研究選擇非甾體類的抗炎藥物尼氟滅酸（niflumic acid），觀察尼氟滅酸和鈣離子通道阻斷劑對(duì)DRG神經(jīng)元GABA激活電流的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料

實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物由新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供的4周齡SD大鼠（200～250 g），雌雄不限，動(dòng)物質(zhì)量符合一級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。葡萄糖酸鉀、膠原酶、胰蛋白酶、胰蛋白酶抑制劑、荷包牡丹堿（bicuculline）、GABA、尼氟滅酸、HEPES為 Sigma公司產(chǎn)品，其余試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 主要儀器

Axon 700B放大器（美國Axon公司）、P-2000拉制儀（美國 Sutter公司）、生物電信號(hào)記錄計(jì)算機(jī)（Axoscope 10.2軟件，美國 Axon公司）。

1.3 細(xì)胞制備

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為4周齡的SD大鼠，擊昏、斷頭后迅速切開背部皮膚沿脊柱兩側(cè)剪斷與之相連的肋骨，取出胸腰段脊柱由脊柱正中剖開成兩半置于O2飽和的細(xì)胞外液中，外液成分為（mmol／L）：NaCl 150；KCl5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；D-glucose 10，pH＝7.4溶液滲透壓為340mOsm。由剖開的椎管內(nèi)側(cè)取出神經(jīng)節(jié)及相連的神經(jīng)前后根和脊神經(jīng)，在顯微鏡下用角膜剪及游絲鑷剪除相連的神經(jīng)和結(jié)締組織，將分離出的DRG剪碎轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，加胰蛋白酶 0.25mg／ml，膠原酶 0.5 mg／ml后移于試管中，在37℃恒溫溫箱中孵育15min。然后加入適量胰蛋白酶抑制劑終止胰蛋白酶的消化。將上述機(jī)械分離和酶處理的 DRG神經(jīng)元離心（1 000 r／min，6 min），然后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿內(nèi)，室溫（20～30℃）下靜置至少30min［5］。

1.4 全細(xì)胞膜片鉗記錄

使用Axon 700B放大器（美國Axon公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)記錄，玻璃微電極用P-2000拉制儀（美國Sutter公司）拉制，電極阻抗約為1～5 MΩ，玻璃微電極所充內(nèi)液成分為（mmol／L）：KCl 140；CaCl21；MgCl22；HEPES 10；EGTA 11，細(xì)胞外液的成分為（mmol／L）：NaCl150；KCl 5；CaCl22.5；MgCl21；HEPES 10；d-glucose 10，在電極與細(xì)胞膜形成高阻（1～5GΩ）封接后將膜吸破然，然后調(diào)節(jié)電容和串聯(lián)電阻補(bǔ)償保持電壓為負(fù) 60mV。膜電流應(yīng)用低通濾波（10 Hz）［5］。藥物均采用無糖外液配制，pH為7.4。給藥系通過微操縱器移動(dòng)快速換液裝置的排藥管進(jìn)行，排藥管的每個(gè)管口的直徑0.5 mm，管口距所記錄的細(xì)胞100 μm，實(shí)驗(yàn)在室溫22～30℃范圍進(jìn)行。GABA激活電流的去敏感擬合采用Clampfit 10.2軟件（美國Axon公司）進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，給藥前后采用兩均數(shù)的t檢驗(yàn)來分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所檢測(cè)的大鼠新鮮分離DRG細(xì)胞呈圓形或橢圓形。實(shí)驗(yàn)選用的細(xì)胞輪廓清晰，折光性強(qiáng)，直徑在20μm～45μm之間，靜息電位為（-59±7.1）mV（n＝223）。其中部分細(xì)胞連有被離斷的軸索突起殘端，呈卷曲狀。

2.1 GABA激活DRG神經(jīng)元的內(nèi)向電流

被測(cè) DRG的神經(jīng)元中有 95.11%（212／223）對(duì)外加 GABA（0.1～1 000μmol／L）敏感，GABA引起明顯的內(nèi)向電流，且具有明顯的去敏感現(xiàn)象（圖1），即雖然GABA持續(xù)存在且濃度不變，但GABA激活電流達(dá)到頂峰后，電流幅值立即呈指數(shù)衰減直到達(dá)到一穩(wěn)定值。GABA激活內(nèi)向電流的 EC50為（28.2±2.5）μmol／L（n＝9）。100μmol／L的 GABA引起的電流幅值為（1.32±0.74）nA（n＝84）。該電流可被GABAA受體特異性拮抗劑荷包牡丹堿（bicuculline，100μmol／L）幾乎完全阻斷 （n＝8，圖 1），這一結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)室前期的研究結(jié)果一致［5］。

Fig.1 Effect of bicuculline（100μmol／L）on the GABAA receptor GABAA：Gamma aminobutyric acid A receptor

2.2 尼氟滅酸濃度依賴性的抑制GABA激活電流

預(yù)灌流不同濃度的尼氟滅酸后，給予相應(yīng)濃度GABA，發(fā)現(xiàn)預(yù)加尼氟滅酸可抑制GABA激活電流的幅值，尼氟滅酸對(duì)GABA激活電流的抑制作用具有濃度依賴性，IC50為（27.24±4.63）μmol／L（n＝56）。1μmol／L、10μmol／L和100μmol／L的尼氟滅酸對(duì)GABA激活電流幅值的抑制率分別為（6.13%±3.21%）（n＝8）、（31.60% ±4.87%）（n＝19）和（59.80%±6.23%）（n＝15，圖 2）。但尼氟滅酸沒有改變 GABA激活內(nèi)向電流的 EC50值（（28.2±2.5）μmol／L，n＝9），與不預(yù)灌流尼氟滅酸相比，GABA激活內(nèi)向電流的 EC50差異無顯著性（P＞0.05）［5］。

Fig.2 Records of GABA（100μmol／L）-activated currents with pretreatment of niflumic acid

2.3 尼群地平濃度依賴性的抑制GABA激活電流

DRG神經(jīng)元全細(xì)胞膜片鉗記錄形成后，胞外給予 GABA（100μmol／L）約5 s，記錄GABA激活電流，外液沖洗2min后再一次記錄GABA激活電流作為前對(duì)照。預(yù)加不同濃度特異性L-型鈣通道阻斷劑尼群地平20 s后，給予相應(yīng)濃度尼群地平與GABA（100μmol／L）混合藥物，記錄 GABA激活電流。預(yù)加 0.1μmol／L、1μmol／L、10μmol／L和 30μmol／L的尼群地平均致GABA激活電流幅值降低，其抑制率分別為（18.90% ±2.14%）（n＝12）、（42.50% ±5.95%）（n＝10）、（43.60%±5.10%）（n＝5）和（49.60%±8.70%）（n＝6），與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖 3）。

Fig.3 Records of GABA（100μmol／L）-activated currents with pretreatment of nitrendipine

2.4 尼氟滅酸對(duì)DRG神經(jīng)元GABA激活電流去敏感的作用

圖4所示，100μmol／L的尼氟滅酸對(duì) GABA激活內(nèi)向電流產(chǎn)生明顯的抑制作用，經(jīng)指數(shù)方程f（t）＝∑Aie-t／τi＋C擬合后（見圖 4中的下圖），發(fā)現(xiàn) GABA激活內(nèi)向電流的去敏感呈雙指數(shù)特性，τ值分別為（14.68±5.11）s（n＝6）和（175.80±42.67）s（n＝6）（r＝0.9647），表明 GABA激活電流的去敏感包括快、慢兩個(gè)時(shí)相［5］。預(yù)加尼氟滅酸之后，GABA激活電流幅值受抑制的同時(shí)，GABA激活電流的去敏感仍為雙指數(shù)特性，τ值分別減少為（4.64±2.21）s（n＝3）和（43.70±14.34）s（n＝3）（r＝0.9548），提示尼氟滅酸抑制GABA激活內(nèi)向電流可能是通過加速去敏感來實(shí)現(xiàn)的。

Fig.4 Tracings and fit curves of the desensitization of GABA（100 μmol／L）-activated currentswith presentand non-presentniflumic acid（100μmol／L）

2.5 氯化鎳對(duì)DRG神經(jīng)元GABA激活電流去敏感的作用

圖5所示，100μmol／L的氯化鎳（非特異性鈣離子通道阻斷劑，包括阻斷L-型電壓依賴性鈣通道）對(duì)GABA激活內(nèi)向電流也有明顯的抑制作用，經(jīng)指數(shù)方程 f（t）＝∑Aie-t／τi＋C擬合后（見圖 5中的下圖），GABA激活內(nèi)向電流的去敏感的雙指數(shù)特性保持不變，τ值分別為（14.68±5.11）s（n＝6）和（175.80±42.67）s（n＝6）（r＝0.9647）。但預(yù)加氯化鎳之后，GABA激活電流幅值受抑制的同時(shí)，GABA激活電流的去敏感仍為雙指數(shù)特性，τ值分別減少為（3.76±2.21）s（n＝3）和（133.45±47.54）s（n＝3）（r＝0.9721），提示氯化鎳抑制 GABA激活內(nèi)向電流主要抑制了快去敏感時(shí)相，對(duì)慢去敏感時(shí)相的作用不明顯。

Fig.5 Tracings and fit curves of the desensitization ofGABA（100 μmol／L）-activated currents with present and non-present niekel chloride（100μmol／L）

3 討論

GABA是脊髓主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在初級(jí)感覺信息傳遞（尤其是傷害性感受）通路的控制中發(fā)揮重要作用。DRG神經(jīng)元膜有GABAA及GABAB受體共存已經(jīng)得到證實(shí)。脊髓GABA能中間抑制性神經(jīng)元釋放GABA作用于初級(jí)傳入終末（DRG假單極神經(jīng)元中樞突末梢）的GABAA受體，增加DRG神經(jīng)元Cl-電導(dǎo)，導(dǎo)致Cl-外流，產(chǎn)生初級(jí)傳入末梢去極化［6］，導(dǎo)致傳入神經(jīng)沖動(dòng)的幅度降低，產(chǎn)生突觸前抑制，減少末梢神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使背角痛敏神經(jīng)元的活動(dòng)減弱，對(duì)初級(jí)感覺傳入尤其是痛覺的上傳起到抑制作用［7］。因此，研究DRG神經(jīng)元GABAA受體的作用和被調(diào)節(jié)機(jī)制，對(duì)闡明初級(jí)感覺信息傳入的突觸前機(jī)制具有重要意義。

已有大量的文獻(xiàn)報(bào)道，NSAIDs對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元GABAA受體功能也存在著重要的調(diào)節(jié)作用［4，8］。GABAA受體作為配體門控離子通道能被很多藥物調(diào)控，包括苯（并）二氮卓類、巴比妥類、類固醇、驚厥劑和麻醉劑［9］。已有報(bào)道，尼氟滅酸對(duì)GABAA和 NMDA受體有調(diào)節(jié)作用［4，8］。甲芬那酸（一種非甾體抗炎藥物）能直接作用于神經(jīng)元膜的GABAA受體［10］。尼氟滅酸也可以作為正性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑作用于α1β2γ2組成的 GABAA受體，另外，尼氟滅酸也能作為負(fù)性變構(gòu)調(diào)節(jié)劑作用于α6β2和α6β2γ2組成的GABAA受體［9］。我們的研究表明，尼氟滅酸沒有改變GABA激活內(nèi)相電流的EC50（約為30μmol／L）值，但明顯使 GABA激活電流最大值減少約60%，表明尼氟滅酸對(duì)GABA激活電流的抑制作用是非競爭性的。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)GABA激活內(nèi)向電流的去敏感呈雙指數(shù)特性，GABA激活電流的去敏感包括快、慢兩個(gè)時(shí)相，τ值分別為（11.60±4.23）s（n＝3）和（175.80±42.67）s（n＝3，r＝0.9616）。預(yù)加尼氟滅酸之后，GABA激活電流幅值受抑制的同時(shí)，GABA激活電流的去敏感仍為雙指數(shù)特性，τ值分別減少為 4.64 s和 43.70 s（r＝0.9548），提示尼氟滅酸抑制GABA激活內(nèi)向電流可能是通過加速去敏感（包括快、慢兩個(gè)時(shí)相）來實(shí)現(xiàn)的。

已有資料表明鈣激活氯通道在神經(jīng)元興奮、平滑肌生理特性的維持等許多生理過程中起重要作用。成年大鼠DRG神經(jīng)元有基礎(chǔ)鈣激活氯通道表達(dá)［11］，研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)損傷可致大、中型DRG神經(jīng)元上鈣激活氯通道表達(dá)的上調(diào)。尼氟滅酸是一種環(huán)氧化酶抑制劑，也是目前公認(rèn)的一種較強(qiáng)的鈣激活氯通道（calcium-activated chloride channels，CaCC）阻斷劑［12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尼氟滅酸對(duì)GABA激活的內(nèi)向電流有明顯的濃度依賴性抑制，表明鈣激活氯通道可能與GABA介導(dǎo)的Cl-外流有關(guān)。而鈣激活氯通道是鈣和電壓依賴性的，鈣激活氯通道取決于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高［12］。為揭示GABA激活電流與Ca2＋的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)預(yù)灌流L-型鈣通道阻斷劑尼群地平和氯化鎳阻斷Ca2＋內(nèi)流后，GABA激活電流幅值明顯降低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Ca2＋在GABA激活氯通道開放中起重要作用，細(xì)胞外Ca2＋內(nèi)流可能通過激活氯通道調(diào)節(jié)GABA激活電流。

由實(shí)驗(yàn)可以推測(cè)：當(dāng)初級(jí)感覺信息傳入脊髓背角，脊髓抑制性中間神經(jīng)元釋放GABA，作用于DRG神經(jīng)元中樞端末梢GABAA受體介導(dǎo)Cl-外流，引起去極化電流產(chǎn)生，膜去極化激活電壓依賴性鈣通道，導(dǎo)致Ca2＋內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度升高激活DRG神經(jīng)元膜上鈣激活氯通道，促進(jìn)Cl-進(jìn)一步外流產(chǎn)生內(nèi)向電流，加速DRG神經(jīng)元的去極化，形成一個(gè)正反饋。結(jié)果使DRG神經(jīng)元傳至初級(jí)傳入終末的動(dòng)作電位幅度變小，時(shí)程縮短，由此使遞質(zhì)的釋放量減少，最終導(dǎo)致脊髓中樞神經(jīng)元的興奮性突觸后電位減小，實(shí)現(xiàn)突觸傳遞的前抑制作用。

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