M 8046對神經病理性疼痛大鼠脊髓和背根節(jié)COX-2／PGE2表達的影響*

歐國昆，王睿嫻，李佳佳，曹 紅，連慶泉，李 軍

（溫州醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院麻醉科，浙江溫州325027）

神經病理性疼痛是一種難治性慢性疼痛，常表現(xiàn)為自發(fā)性疼痛、異常性疼痛及痛覺過敏，疼痛本身是一種應激因素，可以誘導疼痛的易感性增強和加重疼痛的發(fā)生發(fā)展［1］。應激反應激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，造成糖皮質激素分泌增加，中樞神經系統(tǒng)的糖皮質激素受體（glucocorticoid receptor，GR）表達上調，糖皮質激素與分布于脊髓的GR結合后對神經病理性疼痛的調節(jié)起到關鍵的作用［2］。前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）作為重要的炎癥和促傷害介質，在外周和中樞敏化方面均起著十分重要的作用。環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）則是以花生四烯酸（arachidonicacid，AA）為底物生成前列腺素途徑的關鍵酶。CCI（chronic constrictive injury，CCI）模型［3］是一種應用廣泛、可操作性強的神經病理性疼痛動物模型。M8046是一種新型的GR拮抗劑，其對疼痛的影響及對脊髓COX-2、PGE2的影響尚未見報道。本研究擬采用CCI模型探討M8046對神經病理性疼痛大鼠行為學及COX-2、PGE2表達的影響，旨在闡明M8046減緩神經病理性疼痛的相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

M8046（M8046-100MG）購自美國 Sigma公司，兔抗COX-2抗體（250609）購自美國 Abbiotec公司，兔單克隆抗體（PV-6001）購自北京中杉金橋公司，大鼠PGE2ELISA試劑盒（201105232）購自上海西唐生物科技有限公司，336爪／尾刺激痛覺測試計及2390 ELECTRO von-Frey測痛計購自美國ⅡTC公司，顯微鏡（CX41-12L02）購自日本 Olympus公司，顯微熒光照相系統(tǒng)（Nikon E-800）購自日本Nikon公司。

1.2 動物選擇與分組

選用清潔級雄性SD大鼠144只，體重220～250 g，由溫州醫(yī)學院實驗動物中心提供，采用隨機數(shù)字表法，將大鼠分為 4組（n＝36）：假手術組（Sham組）、模型對照組（CCI組）、M8046處理組（M8046組）及溶劑對照組（SC組）。

1.3 大鼠神經病理性疼痛模型的制備

參照 Bernett法［3］制備 CCI大鼠模型：腹腔注射5%水合氯醛400 mg／kg麻醉下，于大鼠右后肢切開皮膚，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經，用4-0號鉻制羊腸線在坐骨神經分叉前間隔1mm打4次松結，松緊度以大腿肌肉或足趾輕微抽動為度，CCI大鼠術后3 d機械縮足反射閾值（PMWT）和熱縮足反射潛伏期（PTWL）下降30%以上，且出現(xiàn)術側爪內收，后足輕度外翻和跛行，顯示模型成功可進入實驗，否則予以剔除。而Sham組僅暴露坐骨神經不作結扎，其余操作相同。

1.4 大鼠機械縮足反射閾值（PMWT）和熱縮足反射潛伏期（PTWL）的測定

于術前 1 d及術后 1、3、7、10、14 d測定各組大鼠PMWT和PTWL。將大鼠置于機械測痛計的鐵絲網架上，待30 min大鼠安靜后，使用2390 ELECTRO von Frey測痛計刺激大鼠右后足掌心，加壓至逃避性抬腿或右后肢抽動，記錄抬腿時施加于大鼠足底的最大力度（g），重復5次，間隔5 min，取平均值即為PMWT。336爪／尾刺激測痛儀測定各組大鼠PTWL值。儀器發(fā)射輻射光照射大鼠右后足底，安靜大鼠逃避性抬腿時，立刻切斷熱源記錄開始照射至出現(xiàn)縮足逃避反射時間（s），重復3次，間隔10～15 min，取平均值即為PTWL，照射截止時間為25 s，以防大鼠足底灼傷。

1.5 免疫組織化學法測定脊髓和背根神經節(jié)COX-2的表達

大鼠分別于術后3、7、14 d三個時間點在麻醉下經主動脈灌注生理鹽水100ml，繼而灌注4%多聚甲醛400 ml處死，制作SD大鼠 L4～5脊髓背角和背根神經節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）石蠟切片，60℃烤片后二甲苯梯度酒精脫蠟，PBS沖洗后抗原高壓熱修復，離開熱源自來水流水冷卻。3%過氧化氫封閉 30min，滴加 1∶200的一抗，4℃孵育 24 h，室溫復溫30min，滴加二抗37℃水浴孵育30 min后PBS沖洗，DAB顯色，蘇木素輕度復染5min，鹽酸化酒精酸化2 s，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，晾干后光鏡觀察。每只動物分別取20張脊髓背角和20張背根節(jié)切片，順序3張選1張在高倍鏡下對脊髓背角及背根神經節(jié)截圖，采用 Image-Pro 5.1圖像分析軟件對COX-2陽性細胞進行染色光密度分析。

1.6 ELISA法測定大鼠脊髓組織PGE2的表達

大鼠分別于術后3、7、14 d三個時間點取脊髓組織，按每100 mg脊髓組織加4 ml生理鹽水的比例，將脊髓組織用微量研磨器磨碎制成勻漿液，將勻漿液進行30倍稀釋后用ELISA試劑盒檢測，按試劑盒說明進行操作，終止反應后用酶標儀在450 nm處測樣本的光密度值，并繪制標準曲線，最后換算出脊髓組織中PGE2的含量。

1.7 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用單因素方差分析（one-factor ANOVA），繼以最小顯著差異法（LSD）行兩兩比較。

2 結果

2.1 腹腔注射 M 8046對 CCI大鼠 PTWL和PMWT的影響

各組間行為學的基礎值差異不顯著（P＞0.05）。Sham組大鼠術后未出現(xiàn)術側爪內收和運動障礙，且各時間點PTWL和PMWT變化差異無顯著性。CCI組PTWL和PMWT從術后第1天開始下降，在第3天降至最低值，與基礎值相比較，差異顯著（P＜0.05），與 Sham組相比，CCI組術后各時間點PTWL和 PMWT明顯降低（P＜0.05）；M8046組大鼠術后PTWL和PMWT亦開始下降，在術后第3天降至最低。與CCI組相比，PTWL、PMWT均從術后第3天開始有明顯升高（P＜0.05），表明腹腔持續(xù)注射M8046能緩解CCI大鼠熱痛覺及機械痛覺過敏；SC組與CCI組各時間點PTWL與PMWL變化差異不顯著（P＞0.05，表 1、2）。

Tab.1 Changes of paw thermalwithdrawal（PTWL）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

Tab.1 Changes of paw thermalwithdrawal（PTWL）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Pre-2 d 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d Sham 12.2±3.9 10.8±3.5 11.4±2.8 12.4±2.0 11.1±2.6 11.8±2.4 CCI 12.7±3.3 9.0±3.5* 6.3±2.0* 6.0±2.5* 5.9±1.0* 7.3±2.3*M8046 12.7±1.7 9.7±2.9 8.9±1.6*＃ 9.5±2.2＃ 10.1±1.5＃ 10.2±1.7＃SC 12.7±4.5 8.9±3.9 7.2±3.3 6.3±1.9 6.5±2.9 6.7±3.2

Tab.2 Changes of pawmechanicalwithdrawal threshold（PMWT）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

Tab.2 Changes of pawmechanicalwithdrawal threshold（PMWT）in four groups of rats（s，±s，n＝12）

CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Pre-2 d 1 d 3 d 7 d 10 d 14 d Sham 42.3±10.2 34.6±8.4 31.6±7.2 32.0±7.7 32.5±10.4 35.3±9.5 CCI 43.0±7.6 26.3±8.2* 19.6±5.8* 16.2±3.2* 16.1±3.6* 15.8±3.6*M8046 44.4±5.2 28.1±7.2* 26.4±5.6*＃ 29.4±8.0＃ 34.1±8.7＃ 34.4±7.5＃SC 43.4±9.4 24.9±9.8 16.9±3.7 17.5±4.3 14.7±3.4 16.3±4.8

2.2 腹腔注射M 8046對CCI大鼠的脊髓背角和背根節(jié)COX-2表達的影響

Sham組大鼠術側脊髓背角有少量COX-2陽性細胞表達，與 Sham組相比，CCI組術側COX-2陽性細胞表達顯著增多（P＜0.05），術后第3天表達達到高峰，隨后下降，而第14天達到另一個高峰；M8046組術側COX-2陽性細胞表達趨勢與CCI組的變化一致，但與 CCI組相比，表達明顯減少（P＜0.05）；SC組術側 COX-2陽性細胞表達與 CCI組基本一致，兩組差異不顯著（P＞0.05，表 3）。腹腔注射M8046對CCI引起背根神經節(jié)與脊髓背角的COX-2表達影響結果一致。

Tab.3 Changes of the number of COX-2 positive cells in spinal dorsalhorn and dorsal rootganglion in four groups of rats（s，±s，n＝6）

Tab.3 Changes of the number of COX-2 positive cells in spinal dorsalhorn and dorsal rootganglion in four groups of rats（s，±s，n＝6）

COX-2：Cyclooxygenase-2；CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group Spinal dorsal horn 3 d 7 d 14 d Dorsal rootganglion 3 d 7 d 14 d Sham 21.3±5.1 10.5±3.4 15.0±3.5 11.9±3.0 8.0±2.2 5.1±2.4 CCI 50.0±13.8* 31.3±6.1* 53.0±9.9* 16.2±3.0* 24.4±7.6* 24.5±4.9*M8046 25.0±5.8＃ 12.7±3.1＃ 25.3±5.5＃ 12.0±2.2＃ 13.0±2.6*＃ 9.5±2.5＃SC 47.2±10.2 33.9±8.6 46.3±10.0 16.5±2.9 24.5±3.7 25.5±2.8

2.3 腹腔注射 M 8046對 CCI大鼠的脊髓組織PGE2的影響

Sham組大鼠脊髓組織有少量 PGE2表達，與Sham組相比，CCI組從第7天開始表達顯著增多（P＜0.05），術后第 14天表達達到高峰；與 CCI組相比，M8046組的 PGE2表達明顯減少（P＜0.05）；SC組術側PGE2表達與CCI組基本一致，兩組差異不顯著（P＞0.05，表 4）

3 討論

本研究選擇Bennett法制備CCI模型，作為一種經典的神經病理性疼痛模型，大鼠可產生明顯的熱痛覺過敏和機械異常性疼痛，其機制為外周神經損傷和炎癥反應誘發(fā)的神經病理性改變，模擬了臨床上較為常見的外周神經壓迫所引起的神經病理性疼痛。

Tab.4 Changes of PGE2 in spinal tissues in four groups of rats（pg，±s，n＝6）

Tab.4 Changes of PGE2 in spinal tissues in four groups of rats（pg，±s，n＝6）

PGE2：Prostaglandin E2；CCI：Chronic constrictive group；M8046：Glucocorticoid receptor antagonist；SC：Solvent controlled group*P＜0.05 vs Sham；＃P＜0.05 vs CCI

Group 3 d 7 d 14 d Sham 313±93 268±61 340±62 CCI 374±79 447±61* 518±99*M8046 382±43 337±106＃ 352±136＃SC 320±119 439±128 622±72

本實驗CCI術后大鼠出現(xiàn)術側跛行，自發(fā)性抬腿和舔足等行為，且對熱和機械刺激產生明顯的疼痛反應，實驗中觀察到CCI組術后第1天PTWL和PMWT已明顯下降，術后第3天大鼠PTWL和PMWT都較術前下降，為基礎值的49.6%和45.6%，此后繼續(xù)保持痛敏狀態(tài)，與文獻報道［4］相似，表明模型制備成功。

前列腺素是廣泛存在于動物和人體內的一組重要的組織激素，在疼痛的產生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，其中最主要的是PGE2。鞘內注射PGE2誘發(fā)痛覺過敏及觸誘發(fā)痛，癥狀與患者神經病理性疼痛臨床表現(xiàn)非常相似［5］，而 PGES-1-／-基因敲除小鼠神經病理性疼痛癥狀消失［6］，表明PGE2參與誘發(fā)和／或維持階段神經病理性疼痛的形成。PGE2在DRG中能夠通過激活河豚毒素抵抗的鈉通道及電壓依賴性鈣通道直接興奮DRG神經元，通過抑制鉀通道、促進谷氨酸、P物質等的釋放，PGE2還可以增強背根神經節(jié)對緩激肽和辣椒素的敏感性誘發(fā)谷氨酸、P物質等釋放增多［7］。上述表明PGE2在脊髓痛信息的處理過程中以及脊髓敏化的發(fā)展和維持中起重要的作用。PGE2的合成依賴于限速酶COX-2，后者呈誘導性表達，生理狀態(tài)下大多數(shù)組織不表達，在細胞外網狀結構和細胞核邊緣起作用，對許多炎癥過程起反應。Freshwater等［8］在糖尿病所致神經病理性疼痛模型中發(fā)現(xiàn)脊髓COX-2表達明顯增加，痛覺過敏與COX-2、PGE2的表達、釋放增加有關。

本實驗通過建立CCI神經病理性疼痛模型，運用免疫組織化學及ELISA技術，發(fā)現(xiàn)CCI組術后第3、7、14天脊髓背角及背根神經節(jié)中COX-2的表達明顯升高，而PGE2于術后第7天表達明顯增加，說明大鼠坐骨神經結扎所致疼痛引起PGE2的表達相對于COX-2的表達有一定的滯后性。

有研究發(fā)現(xiàn)，GR在周圍神經損傷后表達上調，用GR的拮抗劑RU486可以減輕神經病理性疼痛中出現(xiàn)的異常性疼痛和痛覺增敏，梯度給予糖皮質激素受體拮抗劑RU486可劑量依賴地減緩CCI所致神經病理性疼痛［2］。

本實驗使用新型糖皮質激素受體拮抗劑M8046腹腔注射具有與RU486相似的減緩大鼠CCI神經病理性疼痛的作用。目前一般認為GR與神經病理性疼痛的形成有關。在脊髓，GR存在于背角神經元，這個區(qū)域負責疼痛的傳遞。GR在神經病理性疼痛的機制尚不完全清楚，但一些現(xiàn)象值得注意：（1）大鼠外周神經損傷可增加糖皮質激素濃度，腎上腺切除可消除神經損傷誘導的神經病理性疼痛樣的行為；（2）皮質酮可延長海馬神經元的N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體中介的Ca2＋升高；（3）在脊髓索NMDA受體中介神經病理性疼痛，鞘內注射NMDA受體激動劑劑量依賴性地上調COX-2的表達，而NMDA受體拮抗劑MK801處理后COX-2的表達顯著減少［9］，進一步表明NMDA受體能夠直接調節(jié)COX-2在脊髓中的表達。然而，上調的NMDA受體則因鞘內注射GR拮抗劑而下降［10］，提示NMDA受體作為GR的下游因子并受其調節(jié)。

本研究證實糖皮質激素受體拮抗劑M8046處理后COX-2及其催化產物PGE2的表達均明顯降低，推測COX-2參與神經病理性疼痛的應激過程。

綜上所述，腹腔注射M8046可減輕CCI大鼠熱痛覺過敏和機械痛覺過敏，其機制可能與抑制疼痛引起的應激反應，通過拮抗 GR受體后，GR下調NMDA受體表達，進而減少致痛物質COX-2／PGE2的產生有關。

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