東北黑木耳野生菌株比較*

高 娃 張丕奇 黨阿麗 馬銀鵬 韓增華 戴肖東

（黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010）

東北黑木耳野生菌株比較*

高 娃 張丕奇 黨阿麗 馬銀鵬 韓增華 戴肖東**

（黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱 150010）

對收集的4個野生黑木耳菌株和6個國家認定的菌株進行形態(tài)學和酯酶同工酶的分類鑒定。結(jié)果顯示：菌絲形態(tài)不能有效鑒別供試菌株，野生菌株與其他菌株拮抗顯著；酯酶同工酶譜顯示，10個菌株得到6個酶譜類型，當遺傳相似水平為88％時，測試菌株分為6個類群，4個野生菌株分別聚為不同類群。

黑木耳；野生菌株；酯酶同工酶

黑木耳[Auricularia auricula-Judae(Bull.) Quèl.]屬擔子菌綱，木耳目，木耳科，木耳屬[1]，其富含營養(yǎng)，有補血活血，清肺益氣，滋補強身的功效，深受廣大消費者喜愛。黑龍江省伊春、牡丹江等地區(qū)已形成一定水平的規(guī)模化生產(chǎn)[2]。

我國黑木耳的人工栽培技術(shù)走在了世界前列，而菌種分類鑒定等基礎(chǔ)研究嚴重滯后，菌種質(zhì)量良莠不齊，品質(zhì)無從考證，成為黑木耳生產(chǎn)中的嚴重障礙。20世紀70 年代初蛋白質(zhì)標記在遺傳上應(yīng)用較多[3]，近十年來其在真菌的分類鑒定研究中用于食藥用菌品種的分類鑒定的同工酶以酯酶同工酶為主[4～6]。在黑木耳的菌株鑒別、親緣關(guān)系分析等研究中也以酯酶同工酶研究較多[7～9]。本文選用6個本研究所選育的經(jīng)國家認證的黑木耳品種和4個采集自黑龍江省不同地區(qū)的野生菌種為材料，研究分析野生菌株的形態(tài)和酯酶同工酶酶譜特性，旨在為野生資源收集和分類鑒定、良種選育、種性鑒定及菌種管理等提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株 供試菌株共10個，1～6號為國家認定品種；7～10號為野生菌株：“晨明4號”采自黑龍江省伊春市晨明鎮(zhèn)，“塔河2號”采自黑龍江省大興安嶺塔河縣，“雙2號”采自黑龍江省雙鴨山市，“加格達奇1號”采自黑龍江省大興安嶺加格達奇區(qū)。所有菌株均由黑龍江省科學院微生物研究所菌種保藏中心提供，菌株編號見表1。

表1 供試菌株

1.2 培養(yǎng)基 母種、菌絲培養(yǎng)和拮抗試驗培養(yǎng)基(cPDA) ：土豆200 g（煮汁1 000 mL），瓊脂粉14 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，蛋白胨0.5 g，維生素B110 mg，pH自然。同工酶制備液體培養(yǎng)基：元蔥200 g（煮汁1 000 mL），蔗糖10 g，阿魏酸0.06 g，pH值自然。

1.3 試驗方法

（1）菌絲形態(tài)及生長速度。將供試菌株分別同時接種于直徑為88 mm的cPDA平板培養(yǎng)基上，接種塊大小為2×2（mm），25 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察菌絲生長情況。每3天測一次菌絲生長速度，并記錄數(shù)據(jù)。

（2）菌絲拮抗試驗。按照無菌操作的要求，將10個供試菌株點接于cPDA平板培養(yǎng)基上，接種點大小為2×2（mm），每個平板均勻接入 3種菌株，25 ℃下恒溫培養(yǎng)，15 d后觀察任意兩個菌種相交區(qū)域之間是否有拮抗現(xiàn)象發(fā)生。

（3）菌株同工酶鑒定。①同工酶樣品的制備： 分別于250 mL三角瓶中裝入80 mL同工酶制備液體培養(yǎng)基，0.10 MPa滅菌20 min，冷卻后每瓶中分別接入母種菌塊（1.5 mm×1.5 mm）10塊，25 ℃靜止培養(yǎng)20 d，200目尼龍網(wǎng)過濾收集菌絲體，用蒸餾水沖洗干凈，加入0.1 mol/L TBE緩沖液（菌絲體g/緩沖液V：1/1），-20 ℃下冰凍16 h。冰浴研磨成糊狀，12 000 r/min低溫（4 ℃）離心20 min，取上清液，為同工酶樣品。置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②電泳：垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度7.5％，pH 8.9；濃縮膠濃度2.5％，pH 6.7；電極緩沖液 Tris-Glycine系統(tǒng)，pH 8.3；點樣40 μL，溴酚蘭指示劑，4 ℃下電泳。濃縮膠電壓120 V，分離膠電壓200 V，電泳4.0 h。③染色：采用醋酸-α-萘酯和堅牢蘭染色，緩沖液為0.1 mol/L、pH 6.4的磷酸鹽緩沖液。

（4）數(shù)據(jù)處理與分析。相對遷移率（Rf）：電泳結(jié)束后先在指示劑移動的位置（ 前沿）作標記；染色后，量出指示劑移動的距離和酶帶移動的距離。Rf= X2/ X1。X1：固定染色前凝膠中指示劑的遷移距離；X2：固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距離。測量Rf時，以酶帶的中部位置為準。

相似系數(shù)：將凝膠上出現(xiàn)的條帶分類，繪圖。按照條帶有無分別賦值，有帶記為1，無帶記為0。按Nei 或Li（1997）公式計算菌株間的相似系數(shù)Se。其公式為：Se=2Mxy/(Mx+My+2Mxy)，式中Mx為x菌株所獨有的譜帶數(shù)，My為y菌株所獨有的譜帶數(shù)，Mxy為x和y菌株所共有的譜帶數(shù)。

聚類分析：根據(jù)供試黑木耳菌株兩兩間的遺傳相似系數(shù)用NTSYS－PC軟件進行聚類分析，構(gòu)建黑木耳菌株相似系數(shù)樹狀圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲形態(tài) 由表2可知，被試菌株菌落外部特征差異較大，主要表現(xiàn)在菌落形態(tài)、氣生菌絲、菌絲顏色，及在培養(yǎng)基質(zhì)中分泌色素情況等方面。1、8號菌絲生長濃密、粗壯，絨毛氈狀，氣生菌絲生長勢旺。2、4、6號菌絲粗壯，成束。3、5、9號菌絲生長稀疏、細弱，絨毛氈狀，氣生菌絲較弱。7、10號菌絲較弱，成束，氣生菌絲長勢較弱。除2、4號外，其他菌株都不同程度地產(chǎn)生色素。生長速度最快的為4號，其次是1號，9號菌絲生長最慢，速度差異性分析表明，除9號外，其他處理間差異不顯著。

表2 菌株菌絲形態(tài)

2.2 菌絲拮抗 試驗結(jié)果表明，被試菌株除1號和2號，4號和5號，5號和6號間無拮抗外，其他菌株間都存在拮抗反應(yīng)。1、2號和3號，4號和6號，7號和8號間拮抗不顯著，野生菌株與認證菌株間拮抗明顯。表明它們與認證菌株親緣遠，為完全獨立的異源菌株。

2.3 野生菌株與栽培菌株酯酶同工酶 菌株酯酶同工酶酶譜見圖1，10個菌株共檢測93條酯酶同工酶譜帶，菌株遷移率不同的譜帶有15條，所有的譜帶均在Rf 0.195～0.766之間，其中Rf 0.195、0.578、0.633、0.668、0.695五處供試菌株都有譜帶。10個菌株得到了6個酶譜類型，其中1、2、3號為一個帶型；4、5、6號為一個帶型。7、8、9、10號菌株各為一個帶型。

2.4 酯酶同工酶的相似系數(shù) 10個菌株兩兩間遺傳相似系數(shù)（Se）的分布范圍在0.600～1.000之間，其中2號和3號、5號和6號相似系數(shù)為1.000，其他菌株間相似系數(shù)較??；相似性最小的為9號和10號，相似系數(shù)僅為0.600。

圖1 供試菌株的酯酶同工酶酶譜

2.5 聚類分析 NTSYS軟件聚類分析得到的酯酶同工酶聚類分析圖見圖2，遺傳相似水平在0.72～1.00之間。從聚類分析樹狀圖可以看出，當遺傳相似水平為79％時，測試的10個黑木耳菌株可分為3大類群；當遺傳相似水平為81％時，測試菌株可分為4大類群；當遺傳相似水平為88％時，測試菌株分為6個類群，第一類群：1、2、3、8號；第二類群：5、6號；第三類群為4號；第四類群為7號；第五類群9號；第六類群為10號。

圖2 供試菌株的酯酶同工酶聚類分析樹狀圖

3 討 論

菌絲拮抗與同工酶譜分析皆可在一定程度上反映菌株間的親緣性，他們間存在著一定的同一性，而菌絲生長形態(tài)則很難反映菌絲間的差異。本試驗的菌絲拮抗性與酯酶同工酶鑒定結(jié)果基本一致，拮抗反應(yīng)差異顯著的菌株，其同工酶譜帶差異也較大；反之亦然。菌絲形態(tài)受外界環(huán)境的影響較大，因此表現(xiàn)型尚不能完全體現(xiàn)其基因型。同工酶判定則是在蛋白、基因水平上反映菌株間的異同，能更準確地反映菌株生化遺傳特性。

本試驗的野生分離菌株與現(xiàn)存栽培菌株間同工酶的譜帶差異顯著，又各自獨立，表明來源于不同地區(qū)的野生菌株在調(diào)控基因上存在地域差異。供試的野生菌株地域較遠，親緣關(guān)系也較遠，證明這些野生菌株在自然界生長的過程中，未受到栽培菌株的雜交干擾，是遺傳育種等基礎(chǔ)研究的很好材料，應(yīng)作為珍貴的野生資源保藏。

[1] 楊新美. 食用菌栽培學[M]. 北京:中國農(nóng)業(yè)出版社, 1995: 1～251.

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[3] 胡能書, 萬賢國. 同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M]. 長沙: 湖南科學技術(shù)出版社, 1985: 1-7.

[4] 杜萍, 陳艷秋. 7個桑黃菌株酯酶同工酶的研究[J].中國食用菌, 2006, 25(2): 40-42.

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現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金資助。

高娃，高級工程師，主要從事食用菌菌種收集、分類、鑒定等研究。E-mail：gw_6019@163.com。

**通訊作者：戴肖東，副研究員。 E-mail：heiweihlj@126.com。