牛病毒性呼吸道疾病診斷技術(shù)研究進(jìn)展

李 鵬，張淑琴，溫永?。?，高維凡

（1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽110866；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林長春130122）

牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease，BRD）是危害全球養(yǎng)牛業(yè)的主要疾病。然而導(dǎo)致BRD的病因是復(fù)雜的，主要是由于傳染性病原引起，包括病毒、細(xì)菌和支原體［1-2］。此外，應(yīng)激和環(huán)境因素也是重要的誘因，例如斷奶、溫度、飼養(yǎng)密度、濕度、粉塵、運輸，不充足的營養(yǎng)等都是對BRD產(chǎn)生影響的因素［3］。近些年來，隨著國內(nèi)外引種的不斷加大，相應(yīng)疾病的各種病原也在不斷增加，BRD變得更為復(fù)雜，因此提出了牛呼吸道綜合征 （Bovine respiratory disease complex，BRDC）的概念。已分離或檢測到的病毒主要有牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）、牛傳染性鼻氣管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）、牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）、牛呼吸道合胞體病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）和牛腺病毒2型（Bovine adenovirus B）等。這些主要的呼吸道病毒可以造成牛的免疫系統(tǒng)受到抑制，并且損害牛的呼吸道上皮細(xì)胞［4］，從而更加容易引起繼發(fā)感染，導(dǎo)致BRDC的發(fā)生。本文討論了4種主要的牛病毒性呼吸道病原BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV相應(yīng)疾病的實驗室診斷技術(shù)，為防控BRDC提供定期檢疫及臨床診斷的技術(shù)參考。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 病毒分離鑒定

BVDV、IBRV、BPIV-3和BRSV可以在牛源的多種細(xì)胞上生長，均可以用牛腎細(xì)胞培養(yǎng)?，F(xiàn)場檢查時應(yīng)采集病牛的鼻腔分泌液或鼻拭子擦拭液，如果剖檢則采取氣管黏膜、肺部病變部位與正常部位交界處的組織，也可采集血液和脾臟等實質(zhì)器官。

對于BVDV血液樣本是最合適的材料，因為無論是帶有母源抗體的小牛，還是急性發(fā)病過后帶有高滴度的抗體，BVDV病毒都可以在血液中的單核細(xì)胞中存活［5］。BVDV可分為致細(xì)胞病變型（cytopathic，CP）和非致細(xì)胞病變型（non-cytopathic，nCP），CP-BVDV能引起感染細(xì)胞變圓，胞漿出現(xiàn)空泡，細(xì)胞單層拉網(wǎng)，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡而從瓶壁上脫落下來。大多數(shù)情況從臨床分離到的是nCP-BVDV型，因此，需要對分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行免疫熒光或RT-PCR鑒定。IBRV會導(dǎo)致細(xì)胞圓縮、聚集成葡萄樣群落，在單層細(xì)胞上形成空洞，有時會發(fā)現(xiàn)巨核合胞體［6］，鑒定致細(xì)胞病變的病毒是否為IBRV，細(xì)胞培養(yǎng)的上清液必須與特異IBRV抗血清或單克隆抗體進(jìn)行中和試驗。被IBRV感染的細(xì)胞，無論在體內(nèi)還是在體外均能形成嗜酸性核內(nèi)包涵體。

BPIV-3能引起單層牛腎細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀，最后導(dǎo)致細(xì)胞從瓶壁上脫落下來。有一些毒株不會產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變，可以使用紅細(xì)胞吸附試驗來確認(rèn)是否有病毒的存在，常用的有牛紅細(xì)胞和豚鼠紅細(xì)胞，但有些毒株要在體外適應(yīng)一段時間后才能出現(xiàn)紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象［7］。BRSV在呼吸系統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)物上生長最好，尤其牛鼻甲細(xì)胞系適于作為分離和培養(yǎng)病毒，病變可見典型的局部細(xì)胞融合，氣球樣細(xì)胞，晚期細(xì)胞開始表現(xiàn)為腫脹、圓縮、聚集，可見多個典型的合胞體形成，最后出現(xiàn)融合細(xì)胞壞死、脫落。病變的細(xì)胞用HE染色，鏡檢可看到嗜酸性核內(nèi)包涵體。但由于病毒的滴度很低，并且不穩(wěn)定，運輸過程中很易失去生存能力，使其敏感度非常低，所以要求嚴(yán)格的運輸過程，盡早接種細(xì)胞，才可獲得滿意的結(jié)果［8］。

1.2 病毒核酸檢測

核酸檢測方法與病毒分離相比有許多優(yōu)點，這是因為后者不受中和抗體的干擾，敏感性和特異性較高，此外，核酸檢測法能夠檢測有感染性的、不完整的或滅活的病毒粒子的基因組DNA或RNA。

張淑琴等［9］根據(jù)GenBank中已公布的BVDV 5′UTR基因序列，設(shè)計合成了一對特異性引物，建立了檢測BVDV的RT-PCR方法。結(jié)果顯示該方法從BVDV Oregon C24V中擴(kuò)增出了特異性片段，而從豬瘟病毒（CSFV）、IBRV、BRSV、BPIV-3中的擴(kuò)增結(jié)果為陰性。陳茹等［10］采用LUX新型熒光PCR技術(shù)原理，以IBRV的gC、gE基因為靶基因，建立了快速檢測IBRV以及鑒別野毒感染和基因缺失疫苗免疫動物的二重實時熒光定量PCR方法。采用該方法檢測全程僅需約2h。Vaucher R D等［11］根據(jù)BPIV-3的 HN基因的保守區(qū)域設(shè)計了一對引物，在所有的檢測樣品中都能夠檢測到大小為1 009bp的目的條帶，敏感性試驗表明，該方法可以檢測到95pg的cDNA，而且與人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、牛皰疹病毒1型沒有交叉反應(yīng)。Almeida R S等［12］應(yīng)用套式RT-PCR檢測了巴西BRSV，主要針對G基因和F基因，其靈敏度很高，說明套式RT-PCR在診斷和流行病學(xué)調(diào)查中有較好的應(yīng)用前景。Boxus M等［13］應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR定量檢測BRSV，結(jié)果顯示該方法比傳統(tǒng)的RT-PCR靈敏100倍，同時實現(xiàn)了定量檢測BRSV核酸。

2 血清學(xué)診斷方法

2.1 病毒中和試驗

用病毒中和試驗可以檢測BVDV的特異性抗體，用200TCID50～500TCID50常量的病毒與用兩倍倍比稀釋的血清作用1h后，加入指示細(xì)胞，置于37℃培養(yǎng)4d～5d后讀數(shù)，能夠阻止50%的接種細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變的血清的最高稀釋倍數(shù)即為抗體的效價，一般采用CP-BVDV，因為這樣可以直接通過觀察病毒的細(xì)胞病變來推測有無抑制病毒活性的中和抗體。IBRV、BPIV-3和BRSV都有明顯的細(xì)胞病變產(chǎn)生，只要有已知標(biāo)準(zhǔn)毒株的免疫血清，通過在敏感細(xì)胞上培養(yǎng)后進(jìn)行中和試驗就可以做出鑒定。

中和試驗是較敏感、特異的血清學(xué)方法，但該方法存在費時費力、試驗周期長、易受不確定因素影響等缺點。

2.2 免疫熒光試驗

從感染動物的組織中用免疫熒光抗體直接檢查病原已經(jīng)成為一項非常重要的技術(shù)。但是，免疫熒光技術(shù)在臨床上用于BVDV時存在一個問題，從BVDV 持續(xù)感染（persistently infected，PI）牛組織樣品中檢測不到足夠的病毒抗原，在很多情況下，在持續(xù)感染牛上BVDV檢測是陰性［14］。一個可能的解釋是BVDV在持續(xù)感染動物上沒有表達(dá)足夠的病毒，從而熒光抗體不能夠顯示足夠的陽性信號。這個問題可以通過使用單克隆抗體進(jìn)行免疫組化試驗來減輕影響。據(jù)報道，間接免疫熒光試驗被用于自然感染牛和試驗感染牛鼻咽上皮細(xì)胞中BRSV抗原的檢測，其中有4%～8%的標(biāo)本為非特異染色，其原因為試驗無客觀終點，定量不嚴(yán)格，免疫熒光技術(shù)需要高水平的技術(shù)人員和高質(zhì)量的試劑，不適應(yīng)大批量樣本檢測。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA）是常用的診斷方法之一，既可以檢測抗體也可以檢測抗原。目前，ELISA方法被廣泛應(yīng)用于牛場牛群的流行病學(xué)調(diào)查。該方法不僅快速敏感，而且操作簡單，對試驗條件和人員水平要求不高，在臨床上可以得到廣泛應(yīng)用。

BVDV抗原捕獲ELISA（antigen-capture ELISA-ACE）使用的目標(biāo)抗原蛋白主要有兩個，一個是 NS3（p80），一個是Erns（E0）［5］。母源抗體存在于小牛的血液樣本中，為了避免假陰性的出現(xiàn)，一般推薦小牛在3個月齡后使用該測試方法。在用ELISA檢測持續(xù)感染牛時，對于小牛來說使用活體組織（如耳朵邊緣）可以避免母源抗體的干擾［15］。王冰等［16］通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了IBRV的gG基因，利用雜交瘤技術(shù)表達(dá)了抗gG蛋白的單抗，并成功建立了IBRV-gG雙抗體夾心ELISA方法，經(jīng)過檢測該方法是有效的，特異性強，有很大的應(yīng)用前景。周玉龍等［17］構(gòu)建了BPIV-3的HN基因原核表達(dá)載體，成功表達(dá)出HN蛋白并初步完成間接ELISA方法的建立，該方法與病毒中和試驗符合率高達(dá)96%，重復(fù)性較好，該方法與牛冠狀病毒、IBRV和BRSV陽性血清無交叉反應(yīng)。Samal S K等［18］使用桿狀病毒表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)BRSV N蛋白，以重組N蛋白為抗原建立間接ELISA診斷方法，并對感染牛進(jìn)行血清流行病學(xué)調(diào)查，與中和試驗相比較，該方法具有較高的敏感性和特異性。Pastey M K等［19］用桿狀病毒表達(dá)載體表達(dá)的F蛋白作包被抗原，建立了檢測BRSV血清抗體的間接ELISA方法，與中和試驗相比較，該方法快速、敏感、特異。

2.4 膠體金檢測技術(shù)

膠體金免疫層析技術(shù)自誕生以來便以其簡便、快速、敏感、特異等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于獸醫(yī)臨床快速檢測和現(xiàn)場診斷上，顯示出了巨大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的應(yīng)用前景。目前，有關(guān)膠體金免疫滲濾法和膠體金免疫層析法在牛病檢測的研究和應(yīng)用包括口蹄疫、牛地方流行性白血病、赤羽病、牛輪狀病毒病、牛病毒性腹瀉、結(jié)核病、牛副結(jié)核病、布魯菌病、牛D型產(chǎn)氣莢膜梭菌腸毒血癥、血吸蟲病、牛新孢子蟲病等［20］。

Kameyama K等［21］建立了快速檢測BVDV抗原的膠體金免疫層析試紙條，該方法與病毒分離鑒定的敏感性和特異性分別為100%和97.2%，為BVDV的快速檢測提供了一種有效的方法。王武軍等［22］建立了檢測IBR抗體的膠體金斑點免疫滲濾法檢測試紙，整個試驗過程僅需5min即可判斷結(jié)果，與藍(lán)舌病、牛赤羽病、牛地方流行性白血病、牛病毒性腹瀉、豬瘟、豬偽狂犬病和豬細(xì)小病毒病的陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)。將該法與用于IBR抗體檢測的ELISA方法同時對300份臨床牛血清樣品進(jìn)行IBR抗體檢測，結(jié)果二者的陽性符合率達(dá)94.4%。

3 多重檢測技術(shù)

目前的BRD不僅僅是單一病原作用的結(jié)果，往往是多種病原混合感染造成嚴(yán)重的BRDC。針對混合感染的多重檢測技術(shù)主要有多重RT-PCR、固相芯片、液相芯片、多重膠體金檢測技術(shù)等。

Thonur L等［23］針對IBRV的糖蛋白B基因、BRSV核衣殼基因、BPIV-3的核蛋白基因設(shè)計的多重反轉(zhuǎn)錄定量PCR（mRT-qPCR），通過對臨床541份樣品檢測與傳統(tǒng)的病毒分離和間接免疫熒光抗體試驗技術(shù)比較，證明了該方法更快速，特異性高，并且比病毒分離和間接免疫熒光抗體技術(shù)更加敏感。Horwood P F等［24］針對BVDV的5′UTR，IBRV的gc基因，BPIV-3的M蛋白基因設(shè)計了多重定量RT-PCR技術(shù)，該技術(shù)可以同時檢測BVDV、IBRV、BPIV-3三種牛呼吸道常見病原，經(jīng)驗證其特異性、敏感性、反應(yīng)效率與單一引物的定量RT-PCR相一致，沒有出現(xiàn)互相干擾的問題。劉曉樂等［25］分別針對BPIV-3特異性NP蛋白保守基因和BVDV保守區(qū)段E2基因設(shè)計2對引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)條件建立了快速鑒別BPIV-3和BVDV的雙重RT-PCR診斷方法，對參考病毒株進(jìn)行梯度稀釋檢測結(jié)果證明該方法檢測BPIV-3的敏感度可達(dá)10-3TCID50／0.1mL，而 BVDV 的 敏 感 度 達(dá)102TCID50／0.1mL。

Puppe W等［26］設(shè)計了多重反轉(zhuǎn)錄PCR-ELISA技術(shù)（mRT-PCR-ELISA），該技術(shù)可以同時檢測人類9種常見的呼吸道病原流感病毒1型、2型，副流感病毒1型、3型，合包體病毒，腸病毒，腺病毒，肺炎支原體和肺炎衣原體。通過對臨床411份樣本檢測與常規(guī)的病毒分離技術(shù)、單引物PCR技術(shù)相比，該技術(shù)是可行的，其敏感度、特異性可以應(yīng)用于臨床檢測及流行病學(xué)調(diào)查。

Anderson S等［27］用美國Luminex公司研制的液相芯片技術(shù)設(shè)計了多重檢測牛血清抗體技術(shù)，可以在一個血清樣本中同時檢測病原BVDV、IBRV、BPIV-3、BRSV相應(yīng)的抗體，并與ELISA相比較，其敏感度、特異性基本一致，實現(xiàn)了一個液相反應(yīng)體系下檢測多種病原抗體的技術(shù)，該技術(shù)最高可同時檢測多達(dá)100種病原，在未來傳染病診斷技術(shù)中有很好的應(yīng)用前景。

4 展望

隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，新標(biāo)記物及新試劑的發(fā)明，將會對傳染病診斷技術(shù)給予新的理論指導(dǎo)。核酸檢測技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，已經(jīng)成為實驗室診斷的主要技術(shù)，目前已經(jīng)發(fā)展為既可定性又可定量的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，下一步是如何建立準(zhǔn)確度高、特異性強的多重核酸檢測技術(shù)。ELISA技術(shù)、膠體金技術(shù)以其使用方便，快速，特異性較高，可大批量檢測樣本等優(yōu)點逐步成為主要的血清學(xué)診斷技術(shù)，在未來臨床診斷中有很好的應(yīng)用前景。針對我國目前動物傳染病種類多，混合感染嚴(yán)重的問題，開發(fā)新一代多重檢測技術(shù)是今后傳染病診斷技術(shù)的發(fā)展方向。

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