巨核細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2的克隆表達(dá)及其與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

張 蕾，張師桃，曾晛陽，張小平，郝凡凡，王 豐，李婉南，付學(xué)奇

（1.吉林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院Fischer細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)實驗室，吉林 長春 130012；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院婦產(chǎn)科，吉林 長春 130033）

蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases，PTPs）與蛋白質(zhì)酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases，PTKs）協(xié)同作用控制著蛋白質(zhì)酪氨酸的磷酸化過程，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長發(fā)育，并在細(xì)胞信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用［1－2］，許多生理及病理現(xiàn)象均與二者的異常表達(dá)相關(guān)［3］。巨核細(xì)胞蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶2（megakaryocyte protein tyrosine phosphatase 2，PTPMEG2）也稱為PTPN9，是一種在細(xì)胞內(nèi)廣泛分布的酶，最初從人的巨核細(xì)胞MEG－01和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞cDNA文庫中克隆獲得［4］。PTPMEG2與其他的細(xì)胞質(zhì)PTP有所不同，PTPMEG2的表達(dá)使其在分泌小泡中積累。研究［5］表明：分泌小泡的融合和增殖均依賴于PTPMEG2的活性調(diào)節(jié)，說明PTPMEG2在分泌小泡的生物發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。雖然PTPMEG2在細(xì)胞中廣泛分布，但到目前為止對PTPMEG2功能的研究還很少。

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以低骨量及骨組織微結(jié)構(gòu)退變?yōu)樘卣鞯囊环N全身性代謝性骨疾病，伴有骨脆性增加和骨強度降低，易發(fā)生骨折等現(xiàn)象。目前已有研究［6］表明：PTPs的活性對破骨細(xì)胞的形成和功能有重要作用。PTPs是參與骨代謝中破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞活動的一個重要因素，低相對分子質(zhì)量的PTPs對成骨細(xì)胞活動發(fā)揮重要作用［7］。但是目前尚未見有關(guān)PTPMEG2與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系方面的研究報道。PTPMEG2主要調(diào)控某些免疫細(xì)胞及造血細(xì)胞的功能，而這些細(xì)胞在骨髓內(nèi)的功能發(fā)揮均依賴于骨髓基質(zhì)細(xì)胞（bone marrow stromal cells，BMSCs），這正是骨組織的來源及骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病根源。因此本文作者推測PTPMEG2與骨質(zhì)疏松癥間可能存在著一定的聯(lián)系。本研究探討PTPMEG2的表達(dá)及其與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，旨在為骨質(zhì)疏松癥的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要試劑 新西蘭大白兔購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物中心，動物合格證號：SCXK－（吉）2008－0005。雌性SD大鼠購于吉林省中醫(yī)研究所動物實驗中心，動物合格證號：SCXK－（吉）2007－0003。對硝基苯磷酸二鈉（pNPP）、Tryptone、Yeast Extract、Q－Sepharose Fast Flow和SP－Sephadex購于Sigma公司。二硫蘇糖醇（DTT）、（不）完全弗氏佐劑、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒和酸性磷酸酶（ACP）試劑盒購于鼎國生物技術(shù)公司。

1.2 PTPMEG2催化結(jié)構(gòu)域的分離純化 編碼PTPMEG2蛋白催化結(jié)構(gòu)域重組體質(zhì)粒由美國俄克拉荷馬大學(xué)趙志壯博士惠贈，將其連接到含有EcoRⅠ酶切位點的表達(dá)載體pT7上，重組體pT7－PTPMEG2質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3細(xì)胞中進(jìn)行高效表達(dá)，并于LB＋Amp培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)。PTPMEG2重組蛋白的可溶性部分通過Q－Sepharose Fast Flow和SP－Sephadex 2種離子交換柱層析進(jìn)行分離純化。其主要過程為PTPMEG2蛋白的菌液上清Q－Sepharose Fast Flow離子交換柱后，用不同濃度的NaCl Buffer Q溶液洗脫，同時以pNPP作為底物活性跟蹤收集洗脫液。收集這部分洗脫液上SP－Sephadex離子交換柱，用不同濃度的NaCl Buffer S溶液洗脫，以pNPP作為底物活性跟蹤收集蛋白洗脫液。測定蛋白純度及酶的比活力。

1.3 多克隆抗體制備 將純化后的PTPMEG2催化結(jié)構(gòu)域凍干粉用0.2mol·L－1、pH 7.0的PBS溶解，蛋白濃度調(diào)節(jié)為1g·L－1，與等體積的完全弗氏佐劑混合、乳化，乳化時間約為30min，通過家兔背部皮下多點注射法進(jìn)行免疫，在基礎(chǔ)免疫的2周后，每隔7d進(jìn)行1次加強免疫，共進(jìn)行3次，最后一次免疫7d后采集血清樣本。采血前家兔需禁食12h，但不禁水。將抗體血清分別按體積比稀釋，于PVDF膜上點樣，采用ECL顯色實驗檢測抗體效價?？乖鞍诐舛日{(diào)節(jié)到10g·L－1，10倍梯度稀釋，于PVDF膜上點樣，采用ECL顯色實驗檢測抗原對抗體的靈敏度。

1.4 建立骨質(zhì)疏松癥動物模型 30只雌性SD大鼠，體質(zhì)量約為200g，隨機分為模型組（n＝15）和對照組（n＝15），記錄體質(zhì)量。對照組大鼠采用生理鹽水灌胃，灌胃量為10mL·kg－1·d－1；模型組大鼠采用7g·L－1維甲酸溶液灌胃，灌胃量為10mL·kg－1·d－1，持續(xù)給藥3周，其間每天記錄大鼠的形態(tài)并稱量體質(zhì)量。如果大鼠骨脆性增加，ACP和ALP表達(dá)水平超出正常范圍，說明建模成功。

1.5 檢測大鼠血清中ACP和ALP水平 對照組及模型組大鼠建模前后均進(jìn)行12h斷食，然后采集血清，用試劑盒檢測大鼠血清中ACP和ALP表達(dá)水平，比較2組大鼠在建模前后血清中ACP和ALP表達(dá)水平的變化。

1.6 骨組織提取、培養(yǎng)BMSCs 處死大鼠，將其浸入75%酒精中消毒10min，在無菌條件下分別取大鼠的股骨及脛骨，去除周圍肌肉及軟組織，于75%酒精中保存，比較2組大鼠腿骨形態(tài)上的差異并記錄。提取大鼠其他組織（肝、脾、腎、肺、大腦、肌肉及卵巢），PBS清洗外周殘余血，加入適量Buffer A溶液研磨，于4℃、15000r·min－1離心15min，取上清備用，沉淀部分于－70℃凍存。取大鼠股骨置于平皿中，DMEM培養(yǎng)基對其進(jìn)行沖洗，用滅菌的剪刀剪去股骨兩端，再向股骨中注射培養(yǎng)基，使BMSCs被沖至另一平皿中，收集細(xì)胞液。1000r·min－1離心5min，加入3mL 0.83%的氯化銨溶液，用于紅細(xì)胞裂解。振蕩10min，1000r·min－1離心5min，PBS清洗2次，1000r·min－1離心5min，取上清備用。沉淀部分加入10mL DMEM，轉(zhuǎn)移中至培養(yǎng)皿中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天記錄細(xì)胞形態(tài)，定期更換培養(yǎng)基，21d后，取細(xì)胞用胰酶進(jìn)行消化，并用Buffer A處理后備用。

1.7 檢測PTPMEG2的表達(dá)水平 取大鼠上述組織用Buffer A提取組織細(xì)胞，將蛋白濃度調(diào)至2g·L－1，進(jìn)行SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blotting檢測。比較2組大鼠各組織中PTPMEG2表達(dá)水平的差異。

1.8 檢測骨髓細(xì)胞（BMCs）、骨髓紅細(xì)胞及BMSCs中PTPMEG2的表達(dá)水平 將提取的BMSCs的蛋白濃度調(diào)整為1g·L－1，經(jīng)SDS－PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后進(jìn)行Western blotting檢測。比較2組大鼠BMCs、骨髓紅細(xì)胞及BMSCs中PTPMEG2表達(dá)水平的差異。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。大鼠血清中ACP和ALP表達(dá)水平以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 PTPMEG2催化結(jié)構(gòu)域蛋白的分離純化 經(jīng)Q－Sepharose Fast Flow離子交換柱后，活性跟蹤發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于0.05～0.10mol·L－1NaCl Buffer Q的洗脫液中。收集這部分洗脫液上SP－Sephadex離子交換柱，活性跟蹤發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于0.2mol·L－1NaCl Buffer S的洗脫液中。將各純化步驟的收集液進(jìn)行SDS－PAGE電泳檢測，凝膠成像分析顯示：在0.2mol·L－1NaCl Buffer S的洗脫液中目的蛋白的純度為94.8%。見圖1。

圖1 PTPMEG2催化結(jié)構(gòu)域蛋白的純化Fig.1 Purification of PTPMEG2

2.2 PTPMEG2多克隆抗體效價及抗原對抗體的靈敏度 PTPMEG2免疫前效價很低，僅在稀釋比為1∶1時可見特異性結(jié)合（圖2A）。經(jīng)PTPMEG2免疫后，效價明顯升高，抗體效價可達(dá)到1∶10000（圖2B）。當(dāng)PTPMEG2抗原量為10ng時，仍可與抗體特異性結(jié)合（圖2C）。

2.3 骨質(zhì)疏松癥模型大鼠大體觀察 模型組大鼠維甲酸灌胃給藥后表現(xiàn)出行動遲緩、食欲下降、脫毛等現(xiàn)象，體質(zhì)量增長幅度也表現(xiàn)出下降的趨勢；對照組大鼠平均體質(zhì)量增加47.44g，模型組大鼠平均體質(zhì)量增加21.12g（2只死亡）。見圖3（封二）。

2.4 大鼠血清中ACP和ALP表達(dá)水平 模型組大鼠血清中ACP及ALP表達(dá)水平在建模后均明顯升高（P＜0.01），而對照組無明顯變化。建模后模型組大鼠血清ACP和ALP表達(dá)水平均高于對照組（P＜0.01）。見表1。

2.5 2組大鼠股骨和脛骨形態(tài)及脆度 在相同條件下，建模后大鼠的股骨和脛骨破碎數(shù)量較多，與其ACP和ALP表達(dá)水平的顯著升高相對應(yīng)。見圖4（封二）。

2.6 大鼠BMSCs的形態(tài)學(xué)改變 取建模前后大鼠股骨及脛骨的骨髓，培養(yǎng)BMCs，培養(yǎng)3d左右，開始有貼壁的紡錘形細(xì)胞出現(xiàn)（圖5，見封二），繼續(xù)培養(yǎng)21d后，可出現(xiàn)大量貼壁的BMSCs。

圖2 免血清PTPMEG2免疫前（A）、免疫后（B）效價和PTPMEG2蛋白靈敏度（C）Fig.2 Titers of rabbit serum PTPMEG2before immunization（A）and after immunization（B）and sensitivity of PTPMEG2 protein（C）

表1 2組大鼠血清ACP和ALP表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of rat serum ACP and ALP expression levels between two groups［n＝5，，λB／（U·L－1）］

表1 2組大鼠血清ACP和ALP表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of rat serum ACP and ALP expression levels between two groups［n＝5，，λB／（U·L－1）］

＊P＜0.01compared with control group；△P＜0.01compared with before modelling.

Group ACP Before modelling After modelling ALP Before modelling After modelling Control 175.1±1.5178.6±1.6162.3±1.1132.5±1.0＊△Model 179.3±1.4247.6±1.7＊△171.9±1.3295.6±1.4＊△

2.7 PTPMEG2在大鼠各組織中的表達(dá)水平 將提取到的大鼠各組織進(jìn)行SDS－PAGE電泳，并進(jìn)行Western blotting法檢測，PTPMEG2在大鼠的各種組織中均有表達(dá)，其中模型組大鼠腎臟組織中PTPMEG2的表達(dá)水平明顯高于對照組，而其在肌肉組織中的表達(dá)水平明顯低于對照組。見圖6。

圖6 PTPMEG2在大鼠不同組織中表達(dá)的電泳圖Fig.6 Electrophoregram of PTPMEG2 expressions in various tissues of rats

2.8 PTPMEG2在BMCs、骨髓紅細(xì)胞和BMSCs中的表達(dá)水平 與對照組比較，模型組大鼠BMCs中PTPMEG2表達(dá)量明顯增加，而在BMSCs中其表達(dá)量無明顯改變（圖7）。模型組大鼠骨髓紅細(xì)胞中PTPMEG2表達(dá)量與對照組比較亦無明顯改變。見圖8。

圖7 PTPMEG2在大鼠BMCs和BMSCs中表達(dá)的電泳圖Fig.7 Electrophoregram of PTPMEG2 expressions in BMCs and BMSCs of rats

圖8 PTPMEG2在大鼠骨髓紅血胞中表達(dá)的電泳圖Fig.8 Electrophoregram of PTPMEG2 expression in bone marrow red cells of rats

3 討 論

本研究中經(jīng)2種離子交換柱層析后，獲得純度為94.8%、比活力為54606U·mg－1的PTPMEG2蛋白純品，并制備了效價為1∶10000的多克隆抗體。

本研究參考Hassan等［8］關(guān)于骨質(zhì)疏松癥動物模型建立的標(biāo)準(zhǔn)，成功建立了大鼠骨質(zhì)疏松癥動物模型。因ACP和ALP水平是骨質(zhì)疏松癥表征的一個重要指標(biāo)［9］，本研究結(jié)果顯示：骨質(zhì)疏松癥模型組大鼠血清ALP及ACP表達(dá)水平和骨脆性均高于對照組，骨質(zhì)疏松癥成骨細(xì)胞可向成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化，骨鈣素、ALP和Ⅰ型膠原的分泌功能部分喪失，使ALP水平降低［10］。本研究中模型組大鼠腎臟組織中PTPMEG2的表達(dá)水平明顯高于對照組，而其在肌肉組織中的表達(dá)水平卻低于對照組?？梢奝TPMEG2有可能與參與肌肉活動的調(diào)節(jié)并與腎功能相關(guān)。BMSCs可以通過體外培養(yǎng)純化的方法獲得，本文作者參考閆冬梅等［11］有關(guān)BMSCs的培養(yǎng)方法成功獲得大鼠股骨及脛骨的BMSCs，結(jié)果表明：與對照組比較，模型組大鼠BMCs中PTPMEG2表達(dá)量顯著增多，而在骨髓紅細(xì)胞和BMSCs中其表達(dá)量無明顯差異。說明PTPMEG2主要表達(dá)于成熟的BMCs中，而在紅細(xì)胞和未分化的BMSCs中則表達(dá)較少。Pittenger等［12］研究表明：近30%的骨髓貼壁細(xì)胞具有分化為成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的特性。說明PTPMEG2主要表達(dá)于成熟的BMCs中，而在紅細(xì)胞和未分化的BMSCs中則表達(dá)較少［13］。骨質(zhì)疏松癥大鼠BMCs中PTPMEG2表達(dá)量增加，且多發(fā)生在骨髓內(nèi)分化成熟的骨細(xì)胞中，說明PTPMEG2可能在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。

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