碲化鎘量子點(diǎn)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖與成骨分化潛能的影響

周煜博，郭 麗，孟春陽(yáng)，李 鵬，盧日峰，楊小玉，尹 飛

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長(zhǎng)春 130033；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院脊柱外科，吉林 長(zhǎng)春 130021）

量子點(diǎn)（quantum dots，QDs）是一種納米材料，具有獨(dú)特的熒光特性，其吸收光譜較寬，發(fā)射光譜較窄，對(duì)熒光淬滅效應(yīng)有一定抗性。碲化鎘QDs（CdTe QDs）與傳統(tǒng)的有機(jī)染料分子比較，具有多種優(yōu)勢(shì)，可以作為活細(xì)胞標(biāo)記物［1］，但其應(yīng)用的前提是不能影響細(xì)胞正常生理代謝。已有研究［2－3］表明：在一定濃度范圍內(nèi)，QDs不會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)和增殖改變；但大部分研究均以腫瘤細(xì)胞系為基礎(chǔ)，基于哺乳動(dòng)物原代細(xì)胞培養(yǎng)的研究還少有報(bào)道。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潛能，靜脈移植后能定位在受損的組織和器官，標(biāo)記后追蹤其體內(nèi)的遷移并探討其作用機(jī)制一直是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)［4－5］。但是BMSCs活體標(biāo)記的前提是標(biāo)記后其增殖和分化均不受到影響，目前有關(guān)CdTe QDs標(biāo)記BMSCs后對(duì)干細(xì)胞分化影響的研究較少。因此，本研究擬探討不同濃度CdTe QDs對(duì)BMSCs增殖與成骨分化的影響，為CdTe QDs作為活細(xì)胞標(biāo)記物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑 新生5d齡Wistar大鼠購(gòu)于吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK－（吉）2008－0005。DMEM／F－12培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco公司，胎牛血清購(gòu)于Hyclone公司，QDs由吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供，發(fā)射波長(zhǎng)546nm（綠色），粒徑2.3nm，乙二醇包被。

1.2 CdTe QDs在培養(yǎng)液中的分散度檢測(cè) 將CdTe QDs分別加入培養(yǎng)液和蒸餾水中，終濃度1×10－6mol·L－1，分別檢測(cè)培養(yǎng)液、CdTe QDs水溶液和培養(yǎng)液溶液的熒光光譜，根據(jù)光譜峰值的位置推測(cè)CdTe QDs在培養(yǎng)液中的分散情況。

1.3 大鼠BMSCs原代培養(yǎng) 新生5d齡Wistar大鼠，斷頭處死后取肱骨與股骨，剔除肌肉，暴露骨髓腔，用DMEM／F－12培養(yǎng)液將骨髓沖出，制成單細(xì)胞懸液。將單細(xì)胞懸液以1×106mL－1的密度接種，15%胎牛血清。3d后換半液，7d后待細(xì)胞90%融合時(shí)傳代。

1.4 MTT法檢測(cè)CdTe QDs對(duì)細(xì)胞增殖的影響將生長(zhǎng)旺盛的第3代BMSCs以5×103個(gè)／孔的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24h，待其細(xì)胞長(zhǎng)滿。用倍比稀釋的方法將CdTe QDs溶于DMEM／F－12培養(yǎng)液中，濃度依次為0、0.1953、0.3906、0.7813、1.5625、3.1250、6.2500、12.5000、25.0000和50.0000nmol·L－1。吸去孔板內(nèi)培養(yǎng)液，加入含有不同濃度CdTe QDs的DMEM／F－12培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)24、48和72h后，加入5g·L－1的MTT溶液，每孔20μL，培養(yǎng)4h后吸去孔內(nèi)液體，加入DMSO，每孔150μL，用酶標(biāo)儀測(cè)定490nm波長(zhǎng)處吸光度（A）值。計(jì)算每個(gè)濃度下的細(xì)胞增殖率，細(xì)胞增殖率（%）＝（暴露組A值－空白組A值）／（對(duì)照組A值－空白組A值）×100%。根據(jù)MTT測(cè)定的細(xì)胞增殖率結(jié)果繪制散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行對(duì)數(shù)線性回歸，根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)增殖抑制濃度（IP50）。

1.5 CdTe QDs對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的影響將生長(zhǎng)旺盛的第3代BMSCs接種在鋪有多聚賴氨酸（PLL）包被的蓋玻片的24孔板中，分別以0.0122、0.0244、0.0488、0.0976和0.1953nmol·L－1CdTe QDs作用48h后，更換成含有地塞米松0.1μmol·L－1、β甘油磷酸鈉10mmol·L－1和50mg·L－1維生素C的DMEM／F－12培養(yǎng)液中，誘導(dǎo)14d，取出蓋玻片，95%預(yù)冷乙醇在－20℃固定細(xì)胞15min。

1.6 茜素紅染色顯示鈣結(jié)節(jié) PBS沖洗蓋片3次，0.1%茜素紅染色，室溫孵育15min，PBS沖洗后50%甘油封片，顯微鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)并計(jì)數(shù)。根據(jù)鈣結(jié)節(jié)形成抑制率結(jié)果繪制散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)做對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行對(duì)數(shù)線性回歸，根據(jù)回歸方程計(jì)算半數(shù)分化抑制濃度（ID50）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用Excel軟件圖標(biāo)工具中線性回歸模塊作為數(shù)學(xué)計(jì)算工具。各組BMSCs的A值和增殖率以表示，組間比較采用方差分析，各組鈣結(jié)節(jié)數(shù)量組間比較采用方差分析，采用F檢驗(yàn)對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 CdTe QDs在培養(yǎng)液中的分散度 光譜檢測(cè)結(jié)果顯示：在蒸餾水中，CdTe QDs的發(fā)射波長(zhǎng)峰值約為540nm，DMEM／F－12培養(yǎng)液分別在450和520nm處有2個(gè)峰值，CdTe QDs的DMEM／F－12溶液也有2個(gè)峰值，主峰處在的波長(zhǎng)約為520nm，可認(rèn)為是其與培養(yǎng)液的融合峰，峰高和半峰寬未發(fā)生明顯改變，主峰未發(fā)生紅移，說(shuō)明其在DMEM／F－12中熒光特性保持完好，分散良好，未發(fā)生聚合。見圖1。

2.2 CdTe QDs作用下BMSCs增殖的變化MTT預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：CdTe QDs對(duì)BMSCs的濃度－效應(yīng)曲線呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系，符合公式Y(jié)＝A·Ln（X）＋B。其中Y為細(xì)胞增殖率，X為濃度，A和B均為常數(shù)。分別對(duì)反映細(xì)胞增殖的MTT結(jié)果和反映細(xì)胞成骨分化的鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果進(jìn)行線性回歸，算出回歸系數(shù)，用F檢驗(yàn)對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。再根據(jù)回歸曲線算出IP50和ID50。根據(jù)Flint采用的方法原理［6］，分別求出IP50和ID50，增殖分化抑制比（IP50／ID50）可作為評(píng)判化合物體外毒性指標(biāo)。

圖1 熒光光譜法檢測(cè)CdTe QDs在不同溶液中的分散度Fig.1 Dispersity of CdTe QDs in different solutions detected with photoluminescence emission spectra

各暴露組的A值與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)的濃度范圍內(nèi)，CdTe QDs對(duì)BMSCs的增殖具有明顯抑制作用。隨著CdTe QDs暴露時(shí)間延長(zhǎng)，其細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸減少，IP50隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)急劇下降。經(jīng)計(jì)算，CdTe QDs暴露24、48和72h的回歸系數(shù)分別為－23.96、－29.61和－24.30，經(jīng)F檢驗(yàn)，回歸方程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的IP50分別為7.25、1.63和0.67nmol·L－1，見表2和圖2。

表1 不同濃度CdTe QDs作用不同時(shí)間后BMSCs的增殖情況Tab.1 The proliferation of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（）

表1 不同濃度CdTe QDs作用不同時(shí)間后BMSCs的增殖情況Tab.1 The proliferation of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（）

＊P＜0.05compared with control group（0nmol·L－1）.

QDs concentration（nmol·L－1）0.1943±0.04150.1965±0.00960.2355±0.04860.19530.1760±0.0185＊0.1633±0.0135＊0.2001±0.0456＊0.39060.1702±0.0162＊0.1383±0.0043＊0.1578±0.0288＊0.78130.1571±0.0230＊0.1268±0.0110＊0.1488±0.0255＊1.56250.1490±0.0107＊0.1215±0.0071＊0.1418±0.0186＊3.12500.1436±0.0157＊0.1230±0.0091＊0.1255±0.0138＊6.25000.1398±0.0076＊0.0995±0.0024＊0.0995±0.0135＊12.50000.1181±0.0039＊0.0768±0.0042＊0.0733±0.0092＊25.00000.1005±0.0089＊0.0620±0.0012＊0.0633±0.0070＊50.00000.0831±0.0046＊0.0556±0.0028＊0.0566±0.00412448720（control）A value（t／h）＊

表2 不同濃度CdTe QDs作用不同時(shí)間后BMSCs的增殖率Tab.2 The proliferation rates of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（，η／%）

表2 不同濃度CdTe QDs作用不同時(shí)間后BMSCs的增殖率Tab.2 The proliferation rates of BMSCs after treated with different concentrations of CdTe QDs for different time（，η／%）

“－”：No data.

QDs concentration（nmol·L－1）2448720 Proliferation rate（t／h）———0.195387.29±12.8380.57±4.9659.59±4.280.390679.33±8.0161.66±2.7654.00±10.950.781365.30±8.7855.07±6.2647.87±12.361.562568.59±7.4651.61±2.5745.35±7.223.125060.96±5.6952.44±4.9741.64±7.376.250062.24±5.2835.68±1.6027.85±7.1712.500047.22±2.7521.12±2.3213.96±4.8825.000034.98±6.1910.52±0.548.66±3.7650.000022.97±3.206.17±1.525.12±2.19

圖2 CdTe QDs對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的濃度－效應(yīng)曲線Fig.2 The concentration－effect curve of inhibitory effect of CdTe QDs on proliferation of BMSCs

2.3 不同濃度CdTe QDs對(duì)BMSCs分化為成骨細(xì)胞的影響 茜素紅染色法顯示鈣結(jié)節(jié)表明：鏡下可見不同大小、不同形態(tài)的紅色鈣化結(jié)節(jié)，隨著CdTe QDs濃度的增加，鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸減少。見圖3（封二）。各濃度組的鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)結(jié)果與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。CdTe QDs對(duì)成骨分化的回歸系數(shù)為－56.15，經(jīng)F檢驗(yàn)，回歸方程具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。經(jīng)計(jì)算，成骨分化ID50為0.0412nmol·L－1。CdTe QDs暴露48h的IP50／ID50＝39.56。

3 討 論

本研究中的大鼠BMSCs與其他文獻(xiàn)所報(bào)道的形態(tài)特性一致，首次傳代后生長(zhǎng)旺盛，2～3d長(zhǎng)滿瓶底，需要再次傳代。倒置顯微鏡下觀察，BMSCs大多呈長(zhǎng)梭形，排列緊密。BMSCs是一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，能夠在增殖的同時(shí)保持分化潛能，已有大量研究［7－10］表明：原代培養(yǎng)擴(kuò)增的BMSCs能夠分化成成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等。因此，干細(xì)胞移植已成為治療各種疑難雜癥的希望。但大多數(shù)干細(xì)胞治療術(shù)仍處于試驗(yàn)階段，而活細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)對(duì)于干細(xì)胞體內(nèi)移植后的追蹤研究非常重要，無(wú)毒、高效的活細(xì)胞標(biāo)記物一直以來(lái)是人們探索的目標(biāo)。

表3 不同濃度CdTe QDs作用下BMSCs向成骨細(xì)胞的分化Tab.3 The differentiation of BMSCs into osteoblasts after treated with different concentrations of CdTe QDs

圖4 CdTe QDs對(duì)BMSCs成骨分化抑制作用的濃度－效應(yīng)曲線Fig.4 The concentration－effect curve of the inhibitory effect of CdTe QDs on BMSCs differentiated into osteoblasts

QDs是一種具有熒光特性的納米材料，獨(dú)特的光學(xué)特性使其成為理想的活細(xì)胞標(biāo)記物，但其細(xì)胞毒性和安全用量一直以來(lái)備受學(xué)者關(guān)注，是目前研究的熱點(diǎn)。本研究中，熒光光譜法檢測(cè)結(jié)果表明：CdTe ODs在DMEM／F－12培養(yǎng)液中分散良好，未發(fā)生聚合。隨著暴露CdTe QDs時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸減慢，暴露24、48和72h的IP50分別為7.25、1.63和0.67nmol·L－1。有研究［11－13］報(bào)道：CdTe QDs可通過(guò)胎盤屏障，穿過(guò)完整的表皮結(jié)構(gòu)，在不借助載體的情況下，一定劑量的CdTe QDs可直接穿過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。早期研究［14］認(rèn)為：CdTe QDs的毒性來(lái)自于進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部后電離出的微量Cd2＋，雖然有研究證明QDs狀態(tài)下的CdTe QDs毒性要比離子狀態(tài)的Cd2＋毒性更大，但仍缺乏有力證據(jù)闡明具體機(jī)制。

CdTe QDs作為干細(xì)胞的活細(xì)胞標(biāo)記物，不僅對(duì)干細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量無(wú)影響，而且對(duì)于干細(xì)胞的分化也不應(yīng)該產(chǎn)生影響。由于Cd2＋在人體中主要蓄積于骨骼，因此本實(shí)驗(yàn)選定成骨細(xì)胞作為BMSCs的誘導(dǎo)方向，觀察CdTe QDs對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：隨著CdTe QDs濃度的增加，BMSCs分化成的成骨細(xì)胞逐漸減少。茜素紅顯示鈣結(jié)節(jié)的方法可以準(zhǔn)確有效地反映成骨細(xì)胞鈣化情況，直接反映間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化程度，本實(shí)驗(yàn)中，平均每視野鈣結(jié)節(jié)數(shù)目隨暴露濃度增大而明顯減少，濃度－效應(yīng)關(guān)系呈對(duì)數(shù)線性，說(shuō)明CdTe QDs抑制成骨分化的效果具有確定性和顯著性。此外，IP50／ID50比值為39.56，說(shuō)明成骨細(xì)胞分化率比細(xì)胞增殖率更加敏感，同時(shí)也說(shuō)明CdTe QDs影響成骨分化的風(fēng)險(xiǎn)大大高于抑制細(xì)胞增殖的風(fēng)險(xiǎn)，因此選擇其作為干細(xì)胞活體標(biāo)記物時(shí)，標(biāo)記濃度的選擇應(yīng)重點(diǎn)考慮其對(duì)干細(xì)胞分化的影響。

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