砷暴露對(duì)肝臟、腎臟氧化損害的研究進(jìn)展

鐘源霞，孫文長(zhǎng)

(大連醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，遼寧 大連116044)

1 砷污染簡(jiǎn)介

砷污染已成為一種重要的環(huán)境危險(xiǎn)因素，許多國(guó)家和地區(qū)已有砷污染的報(bào)道，如印度、孟加拉、中國(guó)、美國(guó)、智利、墨西哥等［1-5］。2001年世界衛(wèi)生組織將飲用水允許的砷含量由原先的50 μg/L 降為10 μg/L［6］，全球70 個(gè)國(guó)家230 多個(gè)地區(qū)遭受砷污染，5 000 多萬(wàn)人口飲用水砷濃度超過(guò)50 μg/L，1 億4 000 萬(wàn)人口飲用水砷濃度超過(guò)10 μg/L［7］。我國(guó)砷污染問(wèn)題同樣非常嚴(yán)重，560 萬(wàn)人口飲用水砷含量超過(guò)50 μg/L，1 500 萬(wàn)人口飲用水砷含量超過(guò)10 μg/L，僅次于孟加拉和印度［7］。

1.1 砷的來(lái)源和暴露途徑

砷在自然界中分布十分廣泛。引起砷污染的主要來(lái)源是地質(zhì)中的砷滲入到地下水引起的飲用水污染。砷在工業(yè)中的應(yīng)用是砷污染的另一個(gè)來(lái)源。砷化鎵或鋁砷化鎵晶體是半導(dǎo)體元件的材料，在提煉和使用這些晶體過(guò)程中會(huì)造成工業(yè)污染［8］。砷的硫化物被用作殺蟲劑，造成了環(huán)境污染［9］。目前As2O3廣泛應(yīng)用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的治療，某些民族醫(yī)學(xué)中也使用含砷藥物，因此藥用砷是砷污染的又一來(lái)源［10-11］。

砷的主要暴露途徑是經(jīng)口攝入，如飲用砷污染的水，攝取砷污染的食物。其次是經(jīng)呼吸道吸收，如冶金和化工廠工人吸入空氣中的含砷粉塵。

1.2 砷的代謝

口服攝入砷的吸收主要發(fā)生在小腸。多數(shù)以三價(jià)無(wú)機(jī)砷形式通過(guò)簡(jiǎn)單擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞。少數(shù)以五價(jià)砷形式進(jìn)入細(xì)胞，隨后還原為三價(jià)砷。砷化合物包括無(wú)機(jī)砷和有機(jī)砷，無(wú)機(jī)砷毒性往往遠(yuǎn)高于有機(jī)砷。無(wú)機(jī)砷主要在肝臟中進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，少數(shù)在肺和腎臟中進(jìn)行，最終生成低毒性的五價(jià)有機(jī)砷，如單甲基化砷酸鹽［monomethylarsonic acid，MMA(V)］和雙甲基化砷酸鹽［dimethylarsinic acid，DMA(V)］，并通過(guò)尿液排出體外。通常砷的排出比較迅速，可以在幾天內(nèi)排出體外，也有的在體內(nèi)滯留數(shù)月甚至更長(zhǎng)時(shí)間［1］。

1.3 砷的致病性

急性砷中毒主要是誤食殺蟲劑及自殺等引起的，主要表現(xiàn)為惡心、嘔吐、腹瀉、腹絞痛等胃腸道癥狀，也可有心肌毒性、腎臟衰竭、呼吸衰竭等表現(xiàn)，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡。慢性砷暴露可以導(dǎo)致機(jī)體多器官損傷，造成皮膚、心血管、肝臟、胃腸道、生殖系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)疾病。其中以皮膚角質(zhì)化、色素沉著最為常見。在肝臟可以引起纖維化、甚至肝硬化。兒童的智力和語(yǔ)言能力都受到影響［2，4，12-14］。流行病學(xué)調(diào)查顯示飲用高砷水與人類皮膚癌、膀胱癌、肝癌、腎癌和肺癌等的發(fā)病率增加有關(guān)［1］。

2 砷的毒性機(jī)制

目前研究認(rèn)為:砷暴露增加體內(nèi)活性氧和活性氮的生成，導(dǎo)致氧化應(yīng)激。增加的活性氧有過(guò)氧自由基(ROO·)，超氧陰離子(O2·–)、單線態(tài)氧(1O2)、羥自由基(·OH)、過(guò)氧化氫(H2O2)和二甲基砷自由基［(CH3)2As·］等［1］。氧化應(yīng)激造成細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)損傷，表現(xiàn)為脂質(zhì)過(guò)氧化和蛋白質(zhì)羰基含量的增加。有研究表明:砷可抑制線粒體呼吸鏈中復(fù)合物的活性導(dǎo)致自由基的大量產(chǎn)生［15］。自由基可與DNA 堿基反應(yīng)，生成8 -羥基-脫氧鳥苷(8 - hydroxydeoxyguanosine)、8 - 氧代- 脫氧鳥苷(8 - Oxo - deoxyguanosine)［1］，造成DNA 的損傷。損傷的DNA 長(zhǎng)期積累可引起突變，最終導(dǎo)致腫瘤。

砷還可抑制線粒體丙酮酸脫氫酶的活性，減少細(xì)胞內(nèi)乙酰輔酶A 的生成，影響三羧酸循環(huán)，造成細(xì)胞內(nèi)ATP 的產(chǎn)生下降。三價(jià)砷易與巰基結(jié)合，抑制細(xì)胞內(nèi)許多含巰基酶和代謝物的活性，尤其抑制抗氧化劑谷胱甘肽的生成。五價(jià)砷在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化為三價(jià)砷，產(chǎn)生毒性效應(yīng)。并且由于砷的電子結(jié)構(gòu)和原子半徑與磷類似，其化學(xué)性質(zhì)也相似，在體內(nèi)糖酵解和細(xì)胞呼吸過(guò)程中，五價(jià)無(wú)機(jī)砷替代磷酸鹽參與高能磷酸鍵的形成，使氧化磷酸化解偶聯(lián)，減少ATP的生成［1］。

砷進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)甲基化通過(guò)尿液排出體外，目前認(rèn)為甲基化是砷的解毒機(jī)制。但最近研究發(fā)現(xiàn):三價(jià)中間體—MMA(III)和DMA(III)具有較高的反應(yīng)活性和致癌性［1］。

體內(nèi)的抗氧化酶和抗氧化代謝物是機(jī)體抵抗氧化應(yīng)激的第一道和第二道防線。砷誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激顯著降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，如:超氧物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過(guò)氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽- S - 轉(zhuǎn)移酶(glutathione - S -transferase，GST)、谷胱甘肽氧化酶(glutathione oxidase，GPx)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)和葡萄糖-6 -磷酸脫氫酶(glucose -6 -phosphate dehydrogenase，G -6 -PD)等，降低抗氧化代謝物水平，如谷胱甘肽(glutathione，GSH)和總硫醇，并增加氧化型谷胱甘肽(glutathione disulfide，GSSG)含量［16］。

3 砷毒性的防治

目前砷毒性的防治主要有螯合劑療法和抗氧化劑療法。

螯合劑療法是應(yīng)用英國(guó)抗路易士藥劑(British anti-lewisite)與砷螯合，降低砷的毒性，加速砷的排出。這主要用于急性砷中毒治療［9，17］。

抗氧化劑可以恢復(fù)失衡的氧化還原系統(tǒng)，保護(hù)細(xì)胞的形態(tài)及活性，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的生成等。治療證明有效的抗氧化劑主要有維生素C、維生素E 和牛磺酸等。砷暴露大鼠同時(shí)補(bǔ)充維生素C 或維生素E，可有效降低肝臟和腎臟組織中過(guò)氧化物的水平［18］。還可以抑制砷誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子- α(tumor necrosis factor -alpha，TNF -α)水平升高及caspase-3 的激活［19］。在慢性砷暴露大鼠中，維生素C 可以降低血清中轉(zhuǎn)氨酶活性，恢復(fù)受損的SOD等抗氧化酶活性［20］。?；撬崾且环NL -半胱氨酸的代謝終產(chǎn)物，在許多組織中大量存在。它可以保護(hù)人體許多器官免受各種有毒物質(zhì)造成的毒性和氧化應(yīng)激損傷。亞砷酸鈉暴露(3 mg/kg，口服，3 周)前5 天補(bǔ)充牛磺酸(100 mg/kg·d)，可防止砷誘導(dǎo)的大鼠腎功能不全、減少活性氧和一氧化氮的產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡［16］。還有研究顯示:?；撬峥梢詼p輕砷誘導(dǎo)的DNA 損傷［21］。硫辛酸是近年來(lái)廣受關(guān)注的抗氧化劑，廣泛分布于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外空間。硫辛酸一方面可直接清除·OH、次氯酸和1O2，另一方面可使細(xì)胞內(nèi)的抗氧化劑再生，如GSH、維生素C 和維生素E 等，在生物系統(tǒng)中發(fā)揮重要的抗氧化作用。此外，硫辛酸既具有水溶性又具有脂溶性，可以跨越血-腦屏障。目前臨床上已將硫辛酸用于糖尿病神經(jīng)損傷的防治［22-23］。Kokilavani等［24］表明:硫辛酸降低砷暴露后肝臟和腎臟中活性氧的產(chǎn)生，降低砷暴露后脂質(zhì)過(guò)氧化物水平，提高砷暴露后抗氧化酶和抗氧化代謝物的水平，對(duì)砷暴露造成的損傷具有保護(hù)作用。

目前慢性砷中毒的治療非常有限，行之有效的方法是提供安全的飲用水及應(yīng)用抗氧化劑［17］。

4 砷對(duì)肝臟損害的實(shí)驗(yàn)研究

肝臟擁有門靜脈和肝動(dòng)脈兩套血液供應(yīng)，無(wú)論是消化道吸收的化學(xué)毒物還是其他途徑進(jìn)入機(jī)體的化學(xué)毒物都可經(jīng)血液循環(huán)迅速達(dá)到肝臟，負(fù)責(zé)人體物質(zhì)與能量代謝的同時(shí)，也是化學(xué)毒物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的主要器官，極易受到化學(xué)物質(zhì)的損害［25］。

Ghatak 等［26］的研究顯示，砷暴露12 個(gè)月，小鼠肝臟表現(xiàn)出了脂肪變性、纖維化等較為嚴(yán)重的病理現(xiàn)象，與人類砷暴露后的肝損害較為類似。

Das 等［27］研究表明:25 mg/L 亞砷酸鈉飲用水暴露6 個(gè)月，大鼠可造成明顯的肝細(xì)胞變性和血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶活性的顯著增加。在該模型中，氧化應(yīng)激的指標(biāo):GSH 水平下降，GSSG 和脂質(zhì)過(guò)氧化物含量增加，抗氧化酶(CAT、SOD)等活性下降，表明砷誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生氧化損傷。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明:砷暴露降低肝細(xì)胞的細(xì)胞活性，且有劑量依賴效應(yīng)。砷暴露的肝細(xì)胞表現(xiàn)出線粒體膜電勢(shì)降低，線粒體細(xì)胞色素c 水平下降，胞漿細(xì)胞色素c 增加。同時(shí)砷暴露肝細(xì)胞還表現(xiàn)出ATP 水平的顯著降低。流式細(xì)胞術(shù)、DNA 凝膠電泳等方法顯示:砷暴露導(dǎo)致肝細(xì)胞的大量凋亡，正常細(xì)胞凋亡率幾乎為零，而砷暴露細(xì)胞為55.23%。免疫印跡顯示:亞砷酸鈉上調(diào)促凋亡蛋白(Bad、Bax)的表達(dá)，下調(diào)抗細(xì)胞凋亡蛋白(Bcl-2、BcL -xL)的表達(dá)。同時(shí)，亞砷酸鈉顯著增加肝臟中PKCδ 的表達(dá)，而不影響其他兩個(gè)主要的蛋白激酶C 亞型(PKCα 和PKCζ)的表達(dá)。應(yīng)用PKCδ 的抑制劑(rottlerin)預(yù)處理肝細(xì)胞可減少砷誘導(dǎo)的磷酸化的PKCδ，顯著增加細(xì)胞活性。PKCδ 抑制劑的應(yīng)用也可抑制砷誘導(dǎo)的JNK 的增加，提示PKCδ 在JNK 的上游。實(shí)驗(yàn)還顯示?；撬峥勺钄郟KCδ 的活化，抑制細(xì)胞凋亡?？傊?，該研究提示砷可以直接作用于線粒體;抗氧化劑?；撬峥梢燥@著改善砷的肝毒性作用。Singh 等［28］應(yīng)用As2O3口服大鼠模型也觀察到砷暴露導(dǎo)致的肝臟損傷，該損傷可通過(guò)補(bǔ)充維生素C 得以有效的改善，進(jìn)一步證實(shí)氧化損傷是砷毒性的重要機(jī)制。

Nrf2 是一種轉(zhuǎn)錄因子，在砷誘導(dǎo)的毒性中起保護(hù)作用。1 mg/L 亞砷酸鈉飲用水方式暴露6 周的Nrf2 + / + 小鼠表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡化變性，而Nrf2 - / -小鼠中則表現(xiàn)為肝臟壞死，并伴隨著巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。10 mg/L 和100 mg/L 砷引起Nrf2 + / +小鼠肝臟壞死。然而，相同劑量的砷則引起Nrf2 - / -小鼠更嚴(yán)重的壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。這些浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞含有嗜酸性粒細(xì)胞，而嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)與脂肪肝和肝纖維化相關(guān)［29］。該研究提示砷暴露激活Nrf2 依賴的抗氧化反應(yīng)，上調(diào)某些抗氧化酶的表達(dá)，如GST。但當(dāng)砷毒性作用過(guò)強(qiáng)時(shí)，超出機(jī)體負(fù)荷，則造成明顯的損害。Nrf2 的保護(hù)作用在細(xì)胞水平上也得到了證實(shí)。

5 砷對(duì)腎臟損害的實(shí)驗(yàn)研究

腎臟是機(jī)體的排泄器官，排出體內(nèi)的代謝廢物，同時(shí)調(diào)節(jié)體液、電解質(zhì)及酸堿平衡。代謝廢物或有毒物質(zhì)在腎小球中濾過(guò)后又在腎小管重吸收，使毒物濃縮或沉積在腎小管中［25］。

亞砷酸鈉(3 mg/kg)口服作用于Wistar 雄性大鼠3 周可造成腎臟損傷。血液檢測(cè)顯示尿素氮和肌酐水平上升;組織學(xué)檢查顯示腎臟有多位點(diǎn)出血，壞死和腎小管水腫［16］。砷暴露導(dǎo)致腎組織中活性氧的生成顯著高于正常對(duì)照，一氧化氮的產(chǎn)生也有增加。同時(shí)砷暴露增加腎臟丙二醛、蛋白質(zhì)羰基等的含量，降低腎臟中抗氧化酶(SOD，CAT，GST，GR，GPX 和G6PD)的活性，提高腎臟中磷酸化p38、磷酸化ERK1/2 及NF -κB(P65)的表達(dá)。砷暴露引起的損傷部分依賴細(xì)胞線粒體的損傷，降低了大鼠腎臟線粒體膜電勢(shì)，提高了胞漿細(xì)胞色素c 的濃度。?；撬釋?duì)該腎臟損傷有保護(hù)作用［16］。砷還可引起腎臟的DNA 損傷，?；撬岷途S生素C 顯示出保護(hù)作用［21］。維生素E、硫辛酸對(duì)砷暴露造成的腎臟損傷也具有保護(hù)作用［18，24］這些都顯示砷的毒性機(jī)理為氧化損傷。

總之，砷暴露可以引起機(jī)體多臟器損傷，砷的毒性機(jī)理目前認(rèn)為是砷誘導(dǎo)機(jī)體生成氧化損傷。砷中毒的防治主要是應(yīng)用螯合劑和抗氧化劑。隨著砷損傷機(jī)理的進(jìn)一步研究，新的防治措施會(huì)給患者帶來(lái)更大的益處。

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