濃香型大曲糖化動(dòng)力學(xué)研究

任 飛 張曉宇

（1.西南科技大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)研究所，四川 綿陽(yáng) 621010；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

以瀘州老窖為代表的濃香型大曲酒是以己酸乙酯為主體香味成分，其風(fēng)格特征：窖香濃郁，綿甜爽凈，回味悠長(zhǎng)［1］。幾十年來(lái)，濃香型大曲酒深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。濃香型大曲含有多種微生物產(chǎn)生的多種酶類，是濃香型大曲酒生產(chǎn)的糖化劑、發(fā)酵劑和生香劑，其品質(zhì)對(duì)曲酒的出酒率和酒質(zhì)都有很大的影響，所以有“曲是酒之骨”的說(shuō)法［2］。濃香型大曲酒的釀造是在中溫（或中溫偏高溫）大曲的作用下，進(jìn)行“雙邊”發(fā)酵——邊糖化邊發(fā)酵。在大曲酒的發(fā)酵過(guò)程中，濃香型大曲的作用如下：①為大曲酒的入窖糟醅中原料的分解提供酶類：液化酶類、糖化酶類、蛋白酶類、脂肪酶類，等等；②為大曲酒的發(fā)酵提供主要菌種來(lái)源，如霉菌、酵母菌、細(xì)菌等；③是大曲酒中一些香味物質(zhì)及香味前體物質(zhì)的來(lái)源；④大曲中淀粉含量高達(dá)57%左右，可以為大曲酒的發(fā)酵提供一部分發(fā)酵原料［3］。濃香型大曲中的糖化酶類主要源于微生物在制曲過(guò)程中新陳代謝作用，糖化酶類在大曲酒生產(chǎn)的邊糖化邊發(fā)酵過(guò)程中起著重要作用。在本試驗(yàn)中通過(guò)測(cè)定大曲的糖化酶類的糖化動(dòng)力學(xué)，研究不同反應(yīng)條件（底物濃度、酶用量、溫度、pH）對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響，為濃香型大曲酒的生產(chǎn)工藝控制提供理論的參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大曲：來(lái)自于四川濃香型大曲酒生產(chǎn)廠家。

乙酸鈉、乙酸、硫酸銅、酒石酸鉀鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、濃鹽酸、磷酸氫二鈉、檸檬酸：均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

試驗(yàn)用水：均為純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)字酸度計(jì)：PHS－25，上海雷磁儀器廠；

電子分析天平：BSA124S，德國(guó)Sartorius公司；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：DGF3006A，重慶銀河試驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 可溶性淀粉溶液的制備 準(zhǔn)確稱取可溶性淀粉，加少量水調(diào)勻，加入沸水中，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后用水定容，制得試驗(yàn)所需的淀粉溶液。使用時(shí)根據(jù)需要稀釋成不同濃度的淀粉溶液。

1.3.2 5%大曲浸出液的制備 5.0g大曲（以絕干曲計(jì)），加入90mL水和10mL乙酸－乙酸鈉緩沖溶液，攪勻，于30 ℃水浴中保溫浸取1h，每隔15min攪拌1次。用脫脂棉過(guò)濾，濾液為5%大曲浸出液（酶液），取上清液置于冰水浴中待用。使用前5min將所需量的大曲浸出液取出，裝入干凈的試管中置于糖化反應(yīng)所需溫度的水浴中，使其達(dá)到需要的溫度。

1.3.3 緩沖液的制備 為了測(cè)定pH 值對(duì)大曲糖化力的影響，需配制pH 值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液［4］。

1.3.4 還原糖含量的測(cè)定 斐林試劑法［5］。

1.3.5 糖化反應(yīng)速率的計(jì)算 因?yàn)樵谥袦匕l(fā)酵時(shí)，反應(yīng)溫度常控制在30 ℃左右。在本試驗(yàn)中，除研究溫度對(duì)酶反應(yīng)的影響外，反應(yīng)溫度均控制在30 ℃。根據(jù)要求改變底物（可溶性淀粉）濃度、酶濃度（酶液用量）、糖化反應(yīng)的pH 值、反應(yīng)溫度，進(jìn)行試驗(yàn)，糖化反應(yīng)時(shí)間均為5 min，糖化反應(yīng)結(jié)束時(shí)用0.1mol／L的NaOH（注：測(cè)定pH 對(duì)糖化反應(yīng)速率的影響時(shí)用0.2mol／L的NaOH）溶液15 mL 終止反應(yīng)，定容至50mL，取5mL反應(yīng)液用斐林試劑法測(cè)定反應(yīng)液中還原糖的含量。同時(shí)做空白對(duì)照，糖化反應(yīng)速率按式（1）計(jì)算：

式中：

V—— 糖化反應(yīng)速率，mg／（mL·min）；

V1——5mL 糖化液消耗0.1% 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，mL；

V0—— 空白對(duì)照消耗的消耗的0.1% 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的體積，mL；

C —— 標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液的濃度，mg／mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 底物濃度對(duì)大曲糖化速率的影響

以不同濃度的可溶性淀粉作為底物，大曲浸出液用量5mL，反應(yīng)溫度30 ℃，準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，加入0.1 mol／L的NaOH 溶液15mL，終止反應(yīng)，定容至50 mL。研究底物濃度變化對(duì)大曲糖化反應(yīng)初速率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 底物濃度對(duì)糖化反應(yīng)速率的影響Figure 1 Effect of substrate on initial rate of saccharification

大曲糖化反應(yīng)是大曲中含有的多種糖化酶共同參與的結(jié)果。由圖1可知，反應(yīng)速率V 對(duì)［S］呈典型的雙曲線關(guān)系符合經(jīng)典的表征酶促反應(yīng)特征的米氏方程的曲線形狀。因此，可將本試驗(yàn)測(cè)得的數(shù)據(jù)與米氏方程進(jìn)行擬合，用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以1／V ～1／［S］作圖，得到如圖2所示的直線。由回歸方程：

可 求 出Vmax＝0.148 0 mg／（mL· min），Km＝25.935 7mg／mL，所以大曲糖化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程為

圖2 Lineweaver－Burk雙倒數(shù)作圖法Figure 2 Lineweaver－Burk plot of initial rate of saccharification with substrate concentration

2.2 酶用量對(duì)反應(yīng)速率的影響

底物濃度為15mg／mL，反應(yīng)溫度為30 ℃，pH 為4.6，糖化酶用量對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖3。由圖3 可知，酶用量與糖化反應(yīng)速率呈線性關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛缺让笣舛却蠛芏?，即［S］＞＞［E］，因此被酶結(jié)合的S 量，亦即［ES］，它與總的底物濃度相比，可以忽略不計(jì)。根據(jù)酶反應(yīng)的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)［6］得出式（4）：

上述兩步反應(yīng)都是可逆的，它們的正反應(yīng)與逆反應(yīng)的速率常數(shù)分別為k1、k2、k3、k4，可以推導(dǎo)得出：

圖3 酶用量對(duì)糖化速率的影響Figure 3 Effect of enzyme concentration on initial rate of saccharification

式（5）表明酶反應(yīng)體系中反應(yīng)速率V 與酶濃度［E］呈正比，與試驗(yàn)結(jié)果相符。

在濃香型大曲酒的生產(chǎn)中，可以通過(guò)大曲的用量來(lái)控制糖化反應(yīng)速率，夏季氣溫較高，要使大曲酒的發(fā)酵過(guò)程符合“前緩、中挺、后緩落”，必須減少用曲量，一般情況下，夏季的用曲量為投糧量的18%，冬季用曲量為投糧量的21%［6，7］。

2.3 pH 對(duì)糖化速率的影響

底物濃度為15mg／mL，糖化反應(yīng)的溫度為30 ℃，酶用量為5mL，利用5mL磷酸氫二鈉－檸檬酸緩沖液調(diào)劑反應(yīng)體系的pH 值，研究在不同的pH 條件下大曲糖化反應(yīng)速率，反應(yīng)結(jié)束時(shí)，用0.2mol／L 的NaOH 溶液終止反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，當(dāng)pH 值在3.0～6.0時(shí)，糖化反應(yīng)速率隨pH 值的升高而逐漸增加；當(dāng)pH 值在6.0～8.0時(shí)，糖化反應(yīng)速率隨pH 的升高而逐漸降低；因此，濃香型大曲糖化酶的最適pH 為6.0。

圖4 pH 對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響Figure 4 Effect of pH on the initial rate of saccharification

在釀造濃香型大曲酒的過(guò)程中，控制入窖糟醅的pH 可以控制糖化反應(yīng)的速率，有利影響有3個(gè)方面：①過(guò)酸或過(guò)堿可導(dǎo)致酶活性的喪失，空間結(jié)構(gòu)被破壞；②當(dāng)pH 值的改變不太劇烈時(shí)，酶雖未變性，活力可能受到影響；③pH 可影響維持酶分子的空間結(jié)構(gòu)有關(guān)基團(tuán)的解離，進(jìn)而影響酶活性部位的構(gòu)象，酶的活性可能受到影響［8］。

由圖4可知，大曲糖化反應(yīng)速率與pH 呈鐘罩形曲線，表明pH 對(duì)大曲中糖化酶類的糖化反應(yīng)的影響與對(duì)單一糖化酶的影響類似。“雙邊發(fā)酵”順利地進(jìn)行，可以提高大曲酒的質(zhì)量和產(chǎn)量。

2.4 溫度對(duì)大曲糖化速率的影響

溫度是影響酶活性的重要因素，研究酶的最適溫度，在工業(yè)生產(chǎn)中有重要的意義［9］。底物濃度為15 mg／mL，pH為4.6，酶液用量為5mL，在不同的溫度條件下測(cè)定大曲的糖化反應(yīng)速率，溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖5。

由圖5可知，在10～50 ℃時(shí)，大曲的糖化反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增加。這是因?yàn)楫?dāng)溫度升高時(shí)，酶催化反應(yīng)與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng)速率加快［8］。在通常情況下，窖池內(nèi)糟醅的發(fā)酵溫度最高不會(huì)超過(guò)40 ℃。在這一溫度范圍之內(nèi)，大曲的糖化反應(yīng)速率隨著溫度的升高而增加。酵母菌在高溫下過(guò)早衰亡，使得發(fā)酵無(wú)法徹底地進(jìn)行下去，到發(fā)酵中期，發(fā)酵相當(dāng)微弱，所以導(dǎo)致了出酒率的下降［6］。濃香型大曲酒傳統(tǒng)的入窖溫度是“熱平地溫冷13 ℃”，也就是控制較低的溫度入窖發(fā)酵，控制“低溫緩慢發(fā)酵”，做到“前緩、中挺、后緩落”。夏季氣溫較高應(yīng)調(diào)整作息時(shí)間，利用氣溫較低的夜間和早晨進(jìn)行生產(chǎn)，盡量避免在氣溫較高的中午進(jìn)行生產(chǎn)，來(lái)減慢糖化反應(yīng)的速率［10，11］。由表1可知，溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)速率有較大的影響，濃香型大曲糖化反應(yīng)速率是溫度的函數(shù)。

圖5 溫度對(duì)大曲糖化反應(yīng)初速率的影響Figure 5 Effect of temperature on the initial rate of saccharification

表1 不同溫度下的糖化反應(yīng)速度Table 1 Initial rate of saccharification in different temperature

將表1中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以lnV－1／T 作圖，可得如圖6所示的直線，R2＝0.988 1，說(shuō)明用阿侖尼烏斯方程擬合本試驗(yàn)數(shù)據(jù)是高度顯著的，表明糖化反應(yīng)速度隨溫度的變化服從阿累尼烏斯（Arrhenius）方程：

式中：

A—— 指前因子；

E—— 活化能，J／mol；

R—— 通用氣體常數(shù)，8.314J／（mol·K）；

T—— 開(kāi)氏溫度，K。

可求出：指前因子A ＝6.21×105mg／（mL·min），活化能E ＝40.966kJ／mol；與鐘穗生等［12］報(bào)道的馬鈴薯淀粉糖化反應(yīng)的活化能E ＝41.165kJ／mol比較接近。

圖6 lnv 與1 000／T 的關(guān)系圖Figure 6 Relationship of lnv with 1 000／T

3 結(jié)論

濃香型大曲作為濃香型大曲酒生產(chǎn)的糖化發(fā)酵劑，含有由多種微生物產(chǎn)生的多種糖化酶。用5%濃香型大曲浸出液水解可溶性淀粉，在pH 4.6、30 ℃的條件下，濃香型大曲糖化酶的米氏方程為V ＝0.148 0［S］／（25.935 75＋［S］）；糖化反應(yīng)的最適pH 值為6.0；在不同溫度下測(cè)定糖化反應(yīng)速率，計(jì)算得到活化能E 為40.966kJ／mol。濃香型大曲糖化酶類的糖化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與單一酶相似，這可能是因?yàn)槊妇哂袑Ｒ恍?，以淀粉為底物時(shí)，只有糖化酶類起作用。通過(guò)控制淀粉濃度（投糧量）、用曲量、入窖酸度和溫度可以使?jié)庀阈痛笄频奶腔l(fā)酵過(guò)程協(xié)調(diào)進(jìn)行，以提高濃香型大曲酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。

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