鹵雞腿廢棄液酶解工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

李 燕 徐 靜 吳祥庭 季燕珍

（1．溫州科技職業(yè)學院，浙江 溫州 325006；2．溫州大學生命與環(huán)境科學學院，浙江 溫州 325000）

在鹵制品加工的蒸煮取肉過程中，會產生大量的鹵制加工的預煮廢棄液。這些廢棄液中含有較多的營養(yǎng)物質，經本實驗室檢測，其中蛋白質含量約為1．54g／100mL、脂肪含量約為1．0g／100mL、氨基酸含量約為0．06g／100mL。目前很多企業(yè)采用生化方法處理廢棄液，但是生化處理需要大量的人力和一定處理成本；也有些企業(yè)將廢棄液直接排放到環(huán)境中，這不僅造成資源的極大浪費，而且對環(huán)境也產生了不良影響［1］。

目前有關鹵制加工廢棄液開發(fā)利用的研究很少。本課題組［1，2］曾采用陶瓷膜對鹵制加工廢棄液進行微濾，再用納濾膜進行濃縮，得到濃縮液。本研究以此為基礎，以所得濃縮廢棄液為原料，利用單因素和Box－Behnken中心組合試驗設計對其酶解工藝進行優(yōu)化，并對酶解液的抗氧化活性進行研究，為深度開發(fā)鹵制加工廢棄液制品提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 主要材料及儀器

鹵雞腿預煮廢棄液：浙江省溫州市東甌食品有限公司，－20 ℃貯藏；

動物蛋白水解酶：酶活力60萬U／g，廣西南寧龐博生物工程有限公司；

其他試劑：均為中國產分析純。

實驗室小型陶瓷膜和多功能膜：LNG－CM－101型，上海朗極化工科技有限公司；

自動凱氏定氮儀：K－370型，瑞士BUCHI有限公司；

日立氨基酸分析儀：L－8800型，日本日立公司；

紫外可見分光光度計：752S型，上海凌光技術有限公司；

酸度計：DELTA320型，梅特勒－托利多國際股份有限公司；

數顯恒溫水浴鍋：HH－2型，國華電器有限公司。

1．2 試驗方法

1．2．1 陶瓷膜微濾鹵雞腿預煮廢棄液 取一定量鹵雞腿預煮廢棄液，用300目網篩過濾，然后用孔徑0．22μm 陶瓷膜，在溫度50℃、操作壓力0．075MPa條件下過濾，去除廢棄液中的雜質以及大分子物質，以減少對納濾膜的污染［1］。

1．2．2 納濾膜濃縮鹵雞腿預煮廢棄液 微濾液再選用360Da的納濾膜，在操作壓力為1．5 MPa，操作溫度為40 ℃，pH 為6．0條件下，通過納濾膜濃縮廢棄液［2］。

1．2．3 鹵雞腿納濾濃縮液酶解單因素試驗 以水解度為評價指標，分別研究酶解時間、加酶量、初始pH 值、酶解溫度對酶解效果的影響，每組試驗重復3 次，結果取平均值。

（1）酶解時間：在酶解溫度50 ℃、初始pH 7．0、蛋白酶加酶量0．8%條件下，研究酶解時間對水解度的影響。

（2）加酶量：在酶解溫度50 ℃、初始pH 7．0、酶解時間6h條件下，研究蛋白酶加酶量對水解度的影響。

（3）初始pH 值：在酶解溫度50 ℃、酶解時間6h、蛋白酶加酶量1．0%條件下，研究初始pH 對水解度的影響。

（4）酶解溫度：在酶解時間6h、蛋白酶加酶量1．0%、初始pH 7．0條件下，研究酶解溫度對水解度的影響

1．2．4 響應面法優(yōu)化酶解條件 在單因素試驗的基礎上，選取對水解度影響較大的因素為自變量，根據Box－Behnken中心組合試驗設計原理［3，4］，以蛋白水解度為響應值，設計響應面試驗，以進一步優(yōu)化酶解工藝條件。

1．2．5 氨基酸態(tài)氮的測定 參照GB／T 5009．39－2003，采用甲醛滴定法。

1．2．6 總氮的測定 參照GB／T 5009．5－2010，采用半微量凱氏定氮法。

1．2．7 水解度（DH）的測定 水解度指水解斷裂的肽鍵數占總肽鍵數的百分比。水解斷裂的肽鍵數可通過水解放出的氨基氮數目來測定［5］。按式（1）計算水解度。

1．2．8 酶解液抗氧化活性的測定

（1）酶解液的還原能力［6］：取2．5mL不同濃度酶解液，加入2．5 mL 0．2 mol／L 的 磷 酸 鈉 緩 沖 液（pH 6．6）和2．5mL 1%的K3［Fe（CN）6］溶液，混勻，50 ℃水浴20 min，加入2．5mL 10%的三氯乙酸，3 000r／min離心10 min，取5mL 上清液加去離子水5mL、0．1%的FeCl3溶液1mL，于700nm 處測定吸光度值。并用BHT 和VC作對照試驗。

（2）酶解液對DPPH 清除力的測定［7］：取2 mL 樣品溶液，加入等體積0．8 mmol／mL 的DPPH 醇溶液，混勻后靜置30min，于517nm 處測定吸光度值。并用BHT 和VC作對照試驗。按式（2）計算DPPH 清除率。

式中：

R——DPPH 清除率，%；

Ax—— 加入樣品溶液后的吸光度；

Ax0—— 樣品溶液本底的吸光度；

A0—— 空白對照液的吸光度。

1．3 數據分析

采用Design－Expert 6．0．5Trial軟件對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果與討論

2．1 鹵制加工廢棄液的膜分離濃縮

鹵制加工廢棄液膜分離濃縮前后蛋白質、游離氨基酸濃度的變化見表1。由表1可知，經納濾膜濃縮后，鹵制加工廢棄液的蛋白質濃度為8．43g／100 mL，游離氨基酸濃度為0．25g／100mL。后續(xù)試驗以濃縮后的鹵制加工廢棄液進行酶解試驗。

表1 膜分離濃縮后廢棄液各成分變化及濃縮倍數Table1 Components and concentration times of membrane separation and concentration

2．2 濃縮廢棄液酶解條件優(yōu)化

2．2．1 酶解時間對水解度的影響 由圖1可知，水解度隨酶解時間的延長而增大，并趨于一個穩(wěn)定值；而水解速率于反應起始階段增加較快，隨后下降，6h后水解速率的增加明顯下降?？紤]到生產成本及對產品品質的影響，后續(xù)試驗的酶解時間控制為6h。

2．2．2 加酶量對水解度的影響 由圖2可知，隨著加酶量的增加，酶對蛋白水解作用增強，水解度呈不斷上升的趨勢，體系水解度和水解速率均隨初始酶濃度的增加而增強，但當加酶量超過1．0%時，酶分子趨向飽和，繼續(xù)增大加酶量其影響不大，水解度上升趨勢變化緩慢。因此，加酶量控制在1．0%左右較為適宜。

2．2．3 初始pH 值對水解度的影響 初始pH 值會影響酶的穩(wěn)定性，從而影響酶解反應。由圖3 可知，隨著初始pH值的增加，水解度也在增加，但是在初始pH 值為7．0之后，水解度呈下降趨勢。這是由于酶有最適pH 值，若偏離最適pH 值，即改變溶液中OH－濃度，會影響蛋白酶自身的解離和底物的解離，從而影響酶解反應，使得酶的反應速率受到抑制，酶解不充分［8］。因此，初始pH 值控制在7．0左右較為適宜。

圖1 酶解時間對水解度的影響Figure1 Effect of different time on the hydrolysis degree

圖2 加酶量對水解度的影響Figure2 Effect of enzyme ammount on hydrolysis degree

圖3 初始pH 值對水解度的影響Figure3 Effect of pH on the hydrolysis degree

圖4 酶解溫度對水解率的影響Figure4 Effect of temperature on the hydrolysis degree

表2 因素水平表Table2 Factors and levels of response surface methodology（RSM）

表3 Box－Bchnken設計方案和試驗結果Table3 Program and experimental results of Box－Bchnken

2．2．4 酶解溫度對水解度的影響 由圖4可知，在一定的范圍內，水解度隨著溫度的上升而不斷增加，但是超過60 ℃之后，水解度趨于緩慢增長且有下降的趨勢。其原因是溫度升高，反應速度加快，但溫度過高會導致酶蛋白變性，酶的穩(wěn)定性也會下降，酶解效率也隨之降低。因此，酶解溫度控制在60 ℃左右較為適宜。

2．2．5 鹵雞腿廢棄濃縮液酶解的響應面試驗分析 在單因素試驗的基礎上，以酶解溫度、初始pH 值、加酶量3個因素為自變量，以蛋白水解度為響應值，設計三因素三水平的試驗。試驗因素的水平取值見表2，試驗設計及結果見表3。

利用Design－Expert 6．0．5Trial軟件對表3試驗數據進行多元回歸擬合，得到動物蛋白酶水解鹵雞腿廢棄濃縮液的回歸方程：

由表4可知，酶解溫度、初始pH 值和加酶量對水解度的影響顯著，三者之間交互作用也顯著。所選用的二次多項模型具有高度的顯著性（P＜0．000 1）。失擬項在0．05水平上不顯著（P＝0．055 8＞0．05），其決定系數為0．998 6，校正決定系數為0．996 8，說明該模型能解釋99．68%。響應值的變化，僅有總變異的0．32%不能用此模型來解釋，說明該模型擬合程度較好，用該模型對鹵雞腿廢棄濃縮液酶解工藝研究進行優(yōu)化是合適的。

表4 試驗結果方差分析表Table4 Variance analysis of ACE－inhibitory activity experiment

圖5 酶解溫度和初始pH 值對水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure5 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and pH on hydrolysis degree

由圖5～7可知，酶解溫度與初始pH 值的交互作用對水解度的影響最大，初始pH 值和加酶量次之，酶解溫度和加酶量再次之。

2．2．6 驗證實驗 根據上述響應面優(yōu)化試驗結果和二次多項回歸方程，利用Design－Expert 6．0．5Trial軟件獲得了各個因素的最佳水解條件組合為酶解溫度59．74 ℃、初始pH值6．94、加酶量1．14%、酶解時間6h，在此水解條件下，水解度預測值為32．15%。為便于操作將最優(yōu)工藝組合修正為酶解溫度60℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解時間6h，以此工藝組合進行3 次驗證實驗，其實測得水解度為32．07%±0．47%，與理論預測值的誤差在±1%以內，說明采用響應面優(yōu)化得到的酶解工藝參數準確可靠，具有實用價值。

2．3 酶解液的抗氧化活性

2．3．1 酶解液的還原能力 以BHT 和VC為對照測定了酶解液的總還原力。由圖8可知，在40μg／mL時，酶解液的還原能力最強，吸光度值為2．27；之后，隨著酶解液濃度的增大，其還原能力稍有下降。在試驗濃度范圍內，酶解液的還原能力均優(yōu)于BHT 和VC，說明酶解液具有較強的還原能力，將其應用于調味基料的制作，可提高調味料的抗氧化性。

2．3．2 酶解液對DPPH 清除作用 由圖9可知，在試驗濃度范圍的酶解液對DPPH 清除率較大，均在80%以上，當酶解液濃度為40μg／mL時，對DPPH 清除率最大，達到90%。在酶解液濃度小于60μg／mL時，酶解液對DPPH 的清除率明顯高于BHT 和VC；濃度大于60μg／mL 后，酶解液與BHT、VC對DPPH 清除效果的清除效果相差不大。說明酶解液具有較強的清除DPPH 自由基的能力。

圖6 酶解溫度與加酶量對水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure6 Response surface plot and contour map showing the effect of temperature and enzyme amount on hydrolysis degree

圖7 初始pH 值與加酶量對水解度影響的曲面圖及等高線圖Figure7 Response surface plot and contour map showing the effect of pH and enzyme amount on hydrolysis degree

圖8 不同濃度酶解液、BHT 和VC 的還原能力比較Figure8 Comparison of reducing power between different concentration of enzymatic hydrolysate，BHT and VC

圖9 不同濃度酶解液、BHT 和VC 對DPPH 的清除率Figure9 Scavenging ability of different concentration enzymatic hydrolysate BHT and VCon DPPH scavvenging rate

3 結論

本試驗采用陶瓷膜對鹵雞腿廢棄液進行分離、納濾膜濃縮，重點探討了鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解工藝條件，并對其抗氧化活性進行研究。結果表明，其最佳酶解工藝為酶解溫度60 ℃、初始pH 值7、加酶量1．14%、酶解時間6h，該條件下酶解液的水解度為32．07%±0．47%；酶解液具有較強的鐵還原能力和清除DPPH 自由基能力，是一種良好的抗氧化物質。按本試驗的方法制備的鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解液可為新型天然調味料的開發(fā)提供基料，這既豐富了調味品市場，又為鹵制加工預煮廢棄液的回收利用提供了新的途徑。但關于鹵雞腿廢棄濃縮液的酶解液中的主要抗氧化成分還有待進一步的研究。

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