氨基多糖含量測(cè)定方法的研究

● 山西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院 賈亮 中北大學(xué)材料學(xué)院 范平

氨基多糖用途十分廣泛，食品工業(yè)及醫(yī)藥界將其稱為“ 第六要素”。其廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、生物技術(shù)、化妝品、水處理、造紙、食品工程等領(lǐng)域。氨基多糖含量的測(cè)定也成為重要的課題，現(xiàn)今其測(cè)定方法有很多種，如乙酰丙酮法、USP 法、HPLC 衍生化法、紫外分光光度法(UV 法)、硫酸苯酚法、硫酸蒽酮法等。但都有其各自的特點(diǎn)，找出一種最佳測(cè)定氨基多糖的方法具有重要意義。

實(shí)驗(yàn)部分

1.實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

實(shí)驗(yàn)所需主要試劑如表1所示

表1 實(shí)驗(yàn)試劑與藥品

2.實(shí)驗(yàn)儀器

UV—754 型紫外分光光度計(jì)。

3.硫酸苯酚法

（1）實(shí)驗(yàn)原理

苯酚法測(cè)定可溶性糖的原理是：糖在濃硫酸作用下，脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物，在10 mg～100 mg 范圍內(nèi)其顏色深淺與糖的含量成正比，且在490 nm 波長下有最大吸收峰，故可用比色法在此波長下測(cè)定。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

準(zhǔn)確稱取對(duì)照品100 mg，制成2.00 mg/mL 溶液于50 mL 容量瓶中備用。然后分別準(zhǔn)確稱量，取上述溶液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 于50 mL 容量瓶中，加水至刻度（相當(dāng)于制備0.08 mg/mL、0.12 mg/mL、0.16 mg/mL、0.20 mg/mL、0.24 mg/mL 的濃度），分別吸取上述溶液各2.0 mL，再加苯酚試劑1.0 mL，搖勻，緩慢滴加濃硫酸5 mL，搖勻后放置5 min，置于沸水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在490 nm處，水作參比測(cè)定各溶液的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。

（3）測(cè)定

取樣品1 g（試樣），稱準(zhǔn)至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中分別吸取上述溶液2.0 mL……規(guī)定執(zhí)行。

（4）回收率的計(jì)算

吸取試品溶液0.5 mL，分別加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，且分別置于25 mL 試管中，補(bǔ)水至2 mL，以下操作按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中加入6%苯酚1.0 mL……規(guī)定執(zhí)行。

4.硫酸蒽酮法

（1）實(shí)驗(yàn)原理

糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍(lán)綠色糠醛衍生物，在一定范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取對(duì)照品溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分別置于25 mL 量瓶中，用蒸餾水定容、搖勻，分別精密量取0.5 mL，加4 mL 濃硫酸，搖勻，5 min后加1 mL 顯色劑，搖勻。置于100 ℃水浴加熱10 min，取出，速冷至室溫后，以0 mL 對(duì)照品溶液制備為空白試劑，以600 nm 為測(cè)定波長測(cè)定各濃度的吸光值。以吸光值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。

（3）測(cè)定

取樣品1 g（試樣），稱準(zhǔn)至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL 的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中分別吸取上述溶液0.5 mL……規(guī)定執(zhí)行。

（4）回收率的計(jì)算

吸取試品溶液0.5 mL，分別各加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于25 mL 試管中，補(bǔ)水至2 mL，以下操作按本法“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中分別吸取上述溶液0.5 mL……規(guī)定執(zhí)行。

5.乙酰丙酮法

（1）實(shí)驗(yàn)原理

氨基葡萄糖在堿性條件下加熱，乙酰丙酮將氨基葡萄糖分子2 號(hào)碳位上的氨基乙酰化，生成帶有吡咯環(huán)的N- 乙酰衍生物。該衍生物與對(duì)二甲氨基苯甲醛反應(yīng)，反應(yīng)物呈紅色，于525 nm 處測(cè)定吸光度。其適用范圍是氨基糖。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密量取100 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL 置于20 mL 比色管中，另取試品溶液5 mL 置于25 mL 比色管中。各加水至5 mL，再另取25 mL 比色管一支，加水5 mL 作為空白。各加乙酰丙酮試劑1.0 mL，搖勻，置沸水浴中準(zhǔn)確加熱25 min，取出，用冰水浴迅速冷卻后，加無醛乙醇3.0 mL，在60 ℃水浴中保溫10 min 后，再加對(duì)二甲氨基苯甲醛試液1.0 mL，強(qiáng)力振搖，并繼續(xù)在60 ℃水浴中保溫1 h，立即用冷水冷卻至室溫，用分光光度計(jì)在525 nm 處，水作參比測(cè)定各溶液的吸光值。計(jì)算即得供測(cè)試樣濃度。以吸光值為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求回歸方程。

（3）測(cè)定

取樣品1 g（試樣），稱準(zhǔn)至0.0001 g。用水溶解后移入25 mL的容量瓶中，加水稀釋至刻度。以下操作按本法“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中各加乙酰丙酮試劑1.0 mL，搖勻……規(guī)定執(zhí)行。

（4）回收率的計(jì)算

吸取試品溶液0.5 mL，分別各加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置于25 mL 試管中，補(bǔ)水至2 mL，以下操作按本法“標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備”中各加乙酰丙酮試劑1.0 mL……規(guī)定執(zhí)行。

結(jié)果分析與討論

1.硫酸苯酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線

硫酸苯酚法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示：

其回歸方程為y = 2.4297x + 0.0098，多次測(cè)得被測(cè)試樣的吸光值平均值為0.416，對(duì)照曲線得其平均濃度為0.167 mg/mL，其回收率為97.7%。

2.硫酸蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線

硫酸蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示：

其回歸線方程為y=4.1037x- 0.0093，多次測(cè)得被測(cè)試樣的平均吸光值為0.765，對(duì)照曲線得其平均濃度為0.186 mg/mL，其回收率為96.5%。

3.乙酰丙酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線

乙酰丙酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示：

其回歸線方程為y=1.0771x- 0.0011，經(jīng)多次測(cè)得被測(cè)試樣的平均吸光值為0.176，對(duì)照曲線得其平均濃度為0.170 mg/mL，其回收率為95.8%。

4.討論

（1）對(duì)所得數(shù)據(jù)的討論

硫酸苯酚法所測(cè)得的羥氨基葡聚多糖（鈉型）含量最小，乙酰丙酮法所測(cè)得的含量居中，而硫酸蒽酮法所測(cè)得的含量最大。苯酚硫酸法方法簡單、靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160 min 以上。蒽酮- 硫酸法幾乎可以測(cè)定所有的碳水化合物，所以用該法測(cè)出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。因此，蒽酮硫酸法測(cè)定結(jié)果偏高于苯酚硫酸法。而乙酰丙酮法所測(cè)得的結(jié)果穩(wěn)定性較好，顯色在10 min～30 min 內(nèi)，穩(wěn)定性較好。

（2）試劑的比較

硫酸苯酚法和硫酸蒽酮法所用的硫酸均為分析純，如果不用分析純則空白大。乙酰丙酮法中，要用到無醛乙醇，主要是由于乙酰丙酮是測(cè)定甲醛含量的主要試劑，如果乙醇中含有醛基則影響測(cè)定結(jié)果，但是無醛乙醇的制備需要很長的時(shí)間，影響實(shí)驗(yàn)的效率。而硫酸苯酚法以及硫酸蒽酮法所用到的試劑都容易制備。蒽酮試劑易氧化、遇水后測(cè)定數(shù)值波動(dòng)較大，且?guī)缀蹩梢詼y(cè)定所有的碳水化合物，所以用該法測(cè)出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。硫酸苯酚法的回收率：結(jié)果顯示平均回收率是97.7%。在3 種實(shí)驗(yàn)方法中最高。

（3）試驗(yàn)方法的比較

表2 各種方法的比較

結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所用的3 種方法中，硫酸蒽酮法所測(cè)結(jié)果數(shù)值偏大，穩(wěn)定性最差，不是測(cè)定氨基多糖含量的最佳方法。而乙酰丙酮法測(cè)量數(shù)值較為準(zhǔn)確，穩(wěn)定性也比較好，但實(shí)驗(yàn)所需的無醛乙醇的制備較為復(fù)雜，使得該方法操作繁瑣。硫酸苯酚法方法簡單、靈敏度高，實(shí)驗(yàn)時(shí)基本不受蛋白質(zhì)存在的影響，并且產(chǎn)生的顏色穩(wěn)定160 min以上，是最佳的測(cè)定氨基多糖含量的方法。