新型羅丹明B-色氨酸熒光探針合成及用于銅離子檢測研究

王 鵬

（西華師范大學(xué) a.化學(xué)化工學(xué)院，b.化學(xué)合成與污染控制四川省重點實驗室，四川 南充 637009）

在有機生命體中，過渡金屬元素扮演著非常重要的角色。銅作為人體必需的微量元素，廣泛分布于生物組織中，其中大部分以金屬蛋白酶的形式存在并起著重要的功能作用。但是當人體內(nèi)殘存的重金屬銅過量時會對人體細胞和組織產(chǎn)生毒性作用，并導(dǎo)致許多神經(jīng)疾病，例如阿爾茨海默氏癥、威爾遜氏病等［1-3］。另外，由于金屬銅被廣泛的應(yīng)用工業(yè)生產(chǎn)中，作為一種重要的環(huán)境污染物，工業(yè)廢銅排放到環(huán)境中也會對環(huán)境造成了很大的污染和危害。熒光檢測技術(shù)是現(xiàn)代分析化學(xué)中的一類重要方法，熒光檢測技術(shù)在生命科學(xué)和環(huán)境化學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著不可替代的作用［4-6］。因此采用熒光光譜分析技術(shù)檢測環(huán)境及活體細胞中Cu2+引起了廣大科研工作者的廣泛興趣并產(chǎn)生很多了富有成效的工作［7-9］。眾所周知，羅丹明衍生物處于螺環(huán)結(jié)構(gòu)時既沒有熒光也沒有顏色；通過金屬離子或者其他因素導(dǎo)致的羅丹明開環(huán)后，羅丹明衍生物發(fā)射出很強的熒光并伴隨明顯的顏色變化［10］。本文以羅丹明B為熒光團，利用多肽固相合成技術(shù)將色氨酸和羅丹明B通過縮合反應(yīng)連接起來合成了熒光探針RW。相比于其他類型熒光探針，探針RW具有合成簡便，水溶性好，靈敏度高，檢測限低及響應(yīng)時間短等優(yōu)勢［11-15］。當探針RW單獨存在時，由于螺環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，探針RW表現(xiàn)出非常微弱的熒光，當向探針RW中加入銅離子之后，由于銅離子誘導(dǎo)的水解反應(yīng)導(dǎo)致羅丹明開環(huán)并釋放出強烈熒光，從而在乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液中實現(xiàn)了對銅離子的高靈敏高選擇性熒光檢測，最低檢測限為128 nM，同時進行了探針RW熒光性質(zhì)研究。

1 實驗部分

1.1 藥品、試劑和儀器

藥品與試劑：Fmoc-Rink Amide樹脂（0.45 mmol／g），羅丹明 B（97%）和 Fmoc-Trp（Boc）-OH（99%）購置于上海淘普生物科技有限公司。脫Fmoc保護基試劑 （六氫吡啶∶N，N-二甲基甲酰胺＝1∶4，V／V），接肽試劑 （二異丙基乙胺∶N，N-二甲基甲酰胺 ＝174∶826，V／V）和多肽裂解液（三氟乙酸∶三異丙基硅烷∶蒸餾水 ＝9.5∶0.25∶0.25，V／V／V）在實驗室自行配制。氫氧化鈉（99%），氯化鈉（99%），苯酚（99%），茚三酮（99%），三氟乙酸（99%）吡啶，4-（2-羥乙基）-1-哌嗪乙磺酸（99%），O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（98%），二異丙基乙胺（98%）和三異丙基硅烷（97%）購置于上海九鼎化學(xué)有限公司。二氯甲烷，N，N-二甲基甲酰胺，乙腈，無水乙醇，無水乙醚，三乙胺和六氫吡啶等化學(xué)試劑均為分析純，購置于利安隆博華（天津）醫(yī)藥化學(xué)有限公司。所有化學(xué)試劑直接使用，沒有進一步處理。

儀器：精騏牌BC-4201型3D搖床（上海鼎科科學(xué)儀器有限公司），25 mL多肽合成管（上海鼎科科學(xué)儀器有限公司），F(xiàn)D-1 Ultra-low freeze dryer型冷凍干燥機（北京比朗實驗設(shè)備有限公司），Agilent 1200液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司），C18半制備分離柱（美國安捷倫科技有限公司），湘儀牌H1850型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司），Precisa XB120A型電子天平（上海天美天平儀器有限公司），Bruker Esquire HCT離子阱質(zhì)譜儀（美國布魯克公司），島津RF-5301PC型熒光分光光度計（日本島津公司）。

1.2 探針RW的合成與表征

探針RW的合成采用多肽固相合成技術(shù)與熒光發(fā)色團修飾技術(shù)，具體合成路線如圖1所示。

（1）稱取0.20 g Fmoc-Rink Amide樹脂，倒入25 mL多肽合成管中，加入10 mL二氯甲烷，浸泡30 min，然后用 N，N-二甲基甲酰胺洗滌3次，向上述含有樹脂的多肽合成管加入5 mL脫除Fmoc保護基試劑，在3D搖床上反應(yīng)30 min；反應(yīng)完分別用N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，無水乙醇，N，N-二甲基甲酰胺各洗滌3次，利用循環(huán)水泵抽干樹脂，進行K氏檢測，若樹脂顏色變成藍紫色，則說明Fmoc-Rink Amide樹脂上Fmoc保護基已經(jīng)完全被脫除，可以進行多肽縮合反應(yīng)。

（2）稱取0.15 g Fmoc-Trp（Boc）-OH和0.20 g HBTU，用 N，N-二甲基甲酰胺溶解，加入到上述多肽合成管中，加入的接肽試劑（40μL），在3D搖床上反應(yīng)1 h。利用循環(huán)水泵抽干，進行K氏檢測，若樹脂顏色不變，說明縮合反應(yīng)進行完全。向多肽合成管加入5 mL脫除Fmoc保護基試劑，在3D搖床上反應(yīng)30 min。然后進行K氏檢測，若樹脂顏色變成藍紫色，則進行下一步。

（3）稱取0.1 g羅丹明B（過量），用N，N-二甲基甲酰胺溶解，然后加入上述多肽合成管中，加入的接肽試劑（40μL）和三乙胺（40μL），在3D搖床上反應(yīng)4 h。反應(yīng)完分別用 N，N-二甲基甲酰胺，二氯甲烷，無水乙醇洗滌3次，利用循環(huán)水泵抽干。進行K氏檢測，若樹脂顏色不變，說明縮合反應(yīng)進行完全。

（4）現(xiàn)配4 mL的多肽裂解液，加入上述反應(yīng)完全的多肽合成管中，在3D搖床上反應(yīng)4 h。將裂解得到的產(chǎn)物倒入25 mL離心管中，加入-20℃無水乙醚，在高速離心機上離心，棄去上清液，即得粗產(chǎn)物。

（5）利用高效液相色譜將粗產(chǎn)物進行純化，由高效液相色譜純化圖可知產(chǎn)物的純度達到檢測要求。產(chǎn)率：89%；1H NMR（400 MHz，CDCl3，25℃）δ（ppm）：8.050-7.850（m，2H），7.707-7.664（m，2H），7.314-7.258（m，2H），7.109-7.080（m，2H），7.040-7.031（m，1H），6.998-6.861（m，3H），6.757（s，1H），6.698-6.548（m，1H），4.450-4.380（m，1H），3.937（br，1H），3.792（br，1H），3.601（q，J＝6.4 Hz，8H），3.506-3.390（m，3H），1.306（t，J＝6.4 Hz，12H）；MS：［RW+H+］+計算值：629.4；測定值：629.2。

圖1 探針 R W的合成路線圖

2 結(jié)果與討論

2.1 溶液配制及實驗條件

利用蒸餾水配置濃度為10-2mol／L的HEPES緩沖溶液，然后以2∶8的體積比向HEPES緩沖溶液中加入乙腈溶液配成乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液體系；利用蒸餾水配置 10-3mol／L的探針 RW 溶液和 10-3mol／L的 14種常見過渡金屬離子（Ag+，Al3+，Ca2+，Cd2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e3+，Hg2+，K+，Mn2+，Na+，Ni2+，Pb2+，Zn2+）溶液。熒光檢測實驗在室溫下進行，熒光檢測時，熒光分光光度計的激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm，激發(fā)波長為525 nm。所有熒光檢測實驗所用條件均相同。

2.2 金屬離子選擇性研究

在熒光比色皿中加入2mL乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液，依次分別加入 20 μL，10-3mol／L的探針 RW和 200μL，10-3mol／L（10 equiv.）的 14種常見金屬離子，并在熒光分光光度計中檢測當14種金屬離子存在時探針RW的熒光發(fā)射強度變化情況，記錄最大發(fā)射峰（580 nm）處的熒光發(fā)射強度。由圖2可知，若用525 nm激發(fā)，在含有探針RW的乙腈-HEPES緩沖溶液中加入Cu2+之后，由于銅離子誘導(dǎo)探針RW發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致探針RW開環(huán)使熒光發(fā)射強度增強，而當其他13種相關(guān)過渡金屬離子加入探針RW之后，探針RW的熒光發(fā)射強度雖然有所增強，但與探針RW單獨存在時相差不多，與銅離子相比基本沒有任何變化。所以在14種金屬離子中，探針RW可以通過“Off-On”型模式特異性檢測Cu2+，而其他相關(guān)金屬離子沒有相同模式的響應(yīng)。這充分說明在525 nm激發(fā)下，在乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液中，探針RW可實現(xiàn)對Cu2+的高選擇性快速檢測，而且熒光響應(yīng)光譜變化明顯。

2.3 金屬離子競爭性研究

探討熒光探針RW的熒光檢測性質(zhì)時，必須考察熒光探針抗其他相關(guān)金屬離子干擾的能力。因此我們做了其他13種相關(guān)金屬離子對Cu2+檢測的熒光競爭性干擾實驗。在熒光比色皿中加入2 mL的乙腈-HEPES（10-2mol／L；p H＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液，20μL，10-3mol／L的探針 RW 和 200μL，10-3mol／L（10 equiv.）的Cu2+，記錄最大發(fā)射峰（580 nm）處的熒光發(fā)射強度，然后分別在上述RW-Cu混合溶液中加入200μL，5×10-3mol／L（50 equiv.）其他13種金屬離子，記錄最大發(fā)射峰（580 nm）處的熒光發(fā)射強度，然后得到13種相關(guān)金屬離子熒光競爭性干擾圖，由圖3可以看出，探針RW在檢測Cu2+的過程中，即使其他金屬離子過量5倍，幾乎對Cu2+的檢測不存在競爭性干擾現(xiàn)象。實驗現(xiàn)象表明探針RW具有良好的抗干擾能力，可應(yīng)用于其他金屬離子存在的復(fù)雜環(huán)境中實現(xiàn)對Cu2+的特異性靈敏檢測。

圖2 探針 R W對 于14種 金屬離子的選擇檢測圖

圖3 其他13種 相關(guān)金屬離子存在時,C u2+檢測的競爭性柱狀圖

2.4 Cu2+熒光滴定研究

為了確定檢測Cu2+的最大飽和濃度，我們做了Cu2+的熒光滴定實驗。在熒光比色皿中加入2 mL的乙腈-HEPES（10-2mol／L；p H＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液和 20μL，10-3mol／L的 RW溶液，然后累計依次加入0～10.0 equiv.（每次0.5equiv.添加）的10-3mol／L的Cu2+進行熒光測量，分別記錄20組最大發(fā)射峰（580 nm）處的熒光發(fā)射強度得到 Cu2+的熒光滴定圖（圖4）。從熒光滴定圖可以看出，在525 nm激發(fā)下，探針RW在最大發(fā)射峰（580 nm）處的熒光發(fā)射強度逐漸增強，并且呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5 Cu2+的檢測限研究

通過Cu2+低濃度時熒光滴定數(shù)據(jù)和線性擬合情況，利用檢測限計算公式3σ／k可以計算出Cu2+的檢測限。在2mL的乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液中，通過逐次等量遞增 Cu2+濃度（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μM），在最大發(fā)射峰（580 nm）處測得系列熒光發(fā)射強度。重復(fù)三組平行實驗取最好的一組并求標準偏差得到線性擬合圖，從圖5可以觀察到，在Cu2+濃度為0～1.2μM范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性曲線（R＝0.9863）。最后，利用檢測限LOD＝3σ／k公式計算出Cu2+的最低檢測限為128 nM。該實驗結(jié)果表明探針RW可以在體外實現(xiàn)對Cu2+的高靈敏檢測。

圖4 Cu2+熒光滴定光譜圖

圖5 Cu2+的檢測限圖

2.6 檢測機理探討

羅丹明B作為熒光染料被廣泛應(yīng)用于熒光探針的設(shè)計中，羅丹明熒光探針具有較大的摩爾消光系數(shù)，較高的熒光量子產(chǎn)率和較長的發(fā)射波長等優(yōu)良光譜性能。另外，羅丹明類探針通常處于螺環(huán)和開環(huán)的平衡狀態(tài)之間，且這兩種存在模式能表現(xiàn)出不同的熒光光譜性質(zhì)，這就使其通常被人們設(shè)計成“Off-On”型熒光探針。如圖6所示，在本論文中，當探針RW單獨存在時，由于羅丹明B螺環(huán)的形成，探針RW表現(xiàn)出非常微弱的熒光，當向探針RW中加入銅離子后，由于銅離子誘導(dǎo)的水解反應(yīng)導(dǎo)致羅丹明開環(huán)并釋放出強烈熒光，從而在乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液中實現(xiàn)了對 Cu2+的高選擇性快速特異性檢測。

圖6 探針 R W的檢測機理圖

3 結(jié) 論

設(shè)計并合成了一個新穎的“Off-On”型熒光探針 RW，利用羅丹明衍生物分子“關(guān)-開”環(huán)原理，在乙腈-HEPES（10-2mol／L；pH＝7.4；V／V＝2∶8）緩沖溶液體系中實現(xiàn)了對銅離子的高靈敏高選擇性熒光檢測，通過熒光選擇性實驗分析發(fā)現(xiàn)探針RW對Cu2+具有很好的特異性熒光檢測性能；通過Cu2+熒光滴定實驗可知探針RW和Cu2+具有良好的線性關(guān)系；通過相關(guān)金屬離子競爭性實驗得到其他13種金屬離子對Cu2+的檢測基本沒有干擾作用；最后，通過計算得到Cu2+的最低檢測限為128 nM。綜上所述，探針RW能夠?qū)崿F(xiàn)對Cu2+高靈敏特異性檢測。