紅皮云杉針葉揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜及多成分定量分析

趙宏博于淼孟繁穎蘇瑞宗希明方洪壯

（1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2哈爾濱市第一醫(yī)院，哈爾濱 150010）

紅皮云杉針葉揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜指紋圖譜及多成分定量分析

趙宏博1于淼1孟繁穎1蘇瑞2宗希明1方洪壯1

（1佳木斯大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯154007；2哈爾濱市第一醫(yī)院，哈爾濱 150010）

目的：建立紅皮云杉針葉揮發(fā)油氣相色譜（GC）-質(zhì)譜（MS）指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量測(cè)定分析方法。方法：采用GC-MS技術(shù)，以HP-5MS色譜柱為分析柱，對(duì)黑龍江省的10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油分別進(jìn)行指紋圖譜的測(cè)定和樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯3個(gè)成分的含量測(cè)定。結(jié)果：指紋圖譜中鑒定了22個(gè)共有峰，10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的指紋圖譜相似度大于0.90；紅皮云杉針葉揮發(fā)油中樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯在含量上存在一定差異。結(jié)論：系統(tǒng)方法學(xué)驗(yàn)證說明該方法可用于紅皮云杉針葉的鑒別與品質(zhì)評(píng)價(jià)。

紅皮云杉；氣相色譜-質(zhì)譜；指紋圖譜；多成分含量測(cè)定

紅皮云杉（Picea koraiensis Nakai）為松科云杉屬植物，又名虎尾松、紅皮臭等，主要分布在我國(guó)小興安嶺、長(zhǎng)白山林區(qū)一帶。松葉揮發(fā)油已被證實(shí)具有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗突變、降血脂、降血壓及抑菌等作用，同時(shí)也是香料、食品及化學(xué)工業(yè)上的重要原料[1-5]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)紅皮云杉與幾種松科植物揮發(fā)油在化合物數(shù)量和含量上存在異同[6]。揭示紅皮云杉揮發(fā)油內(nèi)在的化學(xué)本質(zhì)和

確定某些成分的含量，對(duì)紅皮云杉揮發(fā)油的藥理研究及資源利用有重要意義。在天然藥物的研究中，指紋圖譜結(jié)合多指標(biāo)定量現(xiàn)已被公認(rèn)為是評(píng)價(jià)與控制天然藥物質(zhì)量的有效技術(shù)手段[7-10]。本研究首次建立了紅皮云杉針葉揮發(fā)油氣相色譜（GC）指紋圖譜，對(duì)共有峰進(jìn)行質(zhì)譜（MS）定性，同時(shí)對(duì)樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯3個(gè)高含量成分進(jìn)行定量測(cè)定，數(shù)據(jù)分析結(jié)果可供紅皮云杉揮發(fā)油相關(guān)研究參考。

1 儀器和試藥

HP7890A-5975型 GC-MS聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；標(biāo)準(zhǔn)玻璃揮發(fā)油提取器。

樟腦（批號(hào)100903761）、龍腦（批號(hào)10147015）、乙酸龍腦酯（批號(hào)1000888484）、萘（批號(hào)BCBD 5685V），均由 SIGMA公司所提供；正己烷（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）、無水硫酸鈉(上海綠源精細(xì)化工廠，色譜純）。10批紅皮云杉新鮮針葉（編號(hào)分別為A～J）于2010年8月采于小興安嶺地區(qū)，經(jīng)形態(tài)和顯微鑒定為松科、云杉屬植物紅皮云杉的針葉。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 GC-MS指紋圖譜

2.1.1 供試品溶液的制備 取陰干粉碎后的紅皮云杉針葉約50 g，置1 000 mL圓底燒瓶中，加入10倍量的蒸餾水，加熱回流 6 h，分取油層，加適量無水硫酸鈉脫水，制取揮發(fā)油。取經(jīng)由水蒸汽蒸餾法提取制得的紅皮云杉針葉揮發(fā)油0.1 mL，加正己烷40 mL，搖勻。

2.1.2 GC-MS條件 色譜柱為HP-5MS（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280℃，初始柱溫50℃，以3℃/min升至140℃，保持10 min，以15℃/min升至215℃，以5℃/min升至260℃，保持2 min。載氣為高純氦氣，分流比為40∶1，進(jìn)樣量1 μL。電子轟擊離子源（EI）溫度：230℃，接口溫度 280℃，四級(jí)桿溫度 150℃，掃描范圍30～500 aum，溶劑延遲時(shí)間為3.75 min。

2.1.3 特征峰和參照峰的選擇與確定 通過GC-MS方法得到10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的總離子流圖，選取保留時(shí)間及峰面積比較穩(wěn)定的共有色譜峰共計(jì)22個(gè)（見圖1）。通過NIST08質(zhì)譜庫(kù)對(duì)這22個(gè)色譜峰進(jìn)行定性，22個(gè)色譜峰面積占總峰面積的（82.59±3.13）%。以其中峰面積較大且分離度良好的10號(hào)峰乙酸龍腦酯（21.31 min）為參照峰（S），計(jì)算各峰的相對(duì)質(zhì)量。所選定的共有峰的保留時(shí)間和相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表1。

圖1 10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的共有峰和參照峰

表1 10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的共有峰

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度 取供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次。供試品溶液指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～0.07%，相對(duì)峰面積的RSD為0.50%～2.43%，測(cè)定條件下儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性 取供試品溶液，按上述色譜條件下分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣。供試品溶液指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.03%～0.10%，相對(duì)峰面積的RSD為1.05%～4.42%，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.3 重復(fù)性 同一批紅皮云杉針葉揮發(fā)油6份，分別按2.1.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定。供試品溶液指紋圖譜中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.01%～ 0.05%，相對(duì)峰面積的RSD為0.69%～4.56%，方法重復(fù)性良好。

2.1.4.4 共有模式及相似度 對(duì)10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的指紋圖譜分別按平均值法和中位數(shù)法建立全譜的共有模式，并計(jì)算各指紋圖譜與共有模式的相似度，結(jié)果見表2?？芍鲹]發(fā)油與所建立的共有模式的相似度均大于0.90，所建立的共有模式具有很好的代表性。

表2 10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油的相似度

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 稱取內(nèi)標(biāo)物萘50 mg，置10 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成5 mg/mL的溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取樟腦、龍腦和乙酸龍腦酯對(duì)照品25，25，50 mg置5 mL量瓶中，加正己烷溶解并稀釋至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱中。臨用時(shí)，精密量取適量，用正己烷稀釋。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取揮發(fā)油50 μL，置10 mL量瓶中，加內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加正己烷至刻度。

2.2.4 GC-MS條件 色譜柱為HP-5MS（30 m× 0.25 mm×0.25 μm)石英毛細(xì)管柱，進(jìn)樣口溫度280℃，初始柱溫50℃，以3℃/min升至125℃，后運(yùn)行20 min。載氣為高純氦氣，分流比為40∶1，進(jìn)樣量1 μL。EI溫度230℃，接口溫度280℃，四級(jí)桿溫度150℃，掃描范圍30～500 aum，溶劑延遲時(shí)間為3.75 min。此條件下，樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯及內(nèi)標(biāo)萘的分離度與其鄰近物質(zhì)的分離度均大于1.5，色譜峰的理論板數(shù)均大于10 000。供試品溶液的總離子流圖見圖2。

圖2 紅皮云杉針葉揮發(fā)油定量總離子流1：樟腦；2：龍腦；S：萘（內(nèi)標(biāo)）；3：乙酸龍腦酯

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 線性關(guān)系 精密量取混合貯備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，3.2 mL置10 mL量瓶中，分別加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷稀釋至刻度，搖勻，得1～ 6號(hào)工作液。在上述色譜條件下，吸取1 μL注入氣相色譜儀。以各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面

積的比值（Y）為縱坐標(biāo)，濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制各成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表3。

表3 樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯的回歸方程和線性回歸系數(shù)

2.2.5.2 精密度 取混合對(duì)照品貯備液0.6 mL置10 mL量瓶中，加入1 mL內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷稀釋至刻度，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值。RSD分別為0.2%，0.3%，0.3%，精密度良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性 取供試品溶液，按上述色譜條件下分別在0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，計(jì)算樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值。RSD分別為0.4%，1.9%，1.5%，供試品溶液中樟腦、龍腦、乙酸龍腦酯 3個(gè)成分在24 h內(nèi)均穩(wěn)定性良好。

2.2.5.4 重復(fù)性 取同一批紅皮云杉針葉揮發(fā)油6份，分別按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定，計(jì)算樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值。RSD分別為0.6%，0.4%，0.2%，方法重復(fù)性良好。

2.2.5.5 加樣回收率 精密量取已知樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯含量的揮發(fā)油25 μL共6份，每份分別加入混合儲(chǔ)備液0.3 mL，按2.2.3項(xiàng)下制備方法制得溶液，在設(shè)定的色譜條件下進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算得，樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯的平均回收率（n=6）分別為99.6%（RSD=1.9%），97.1%（RSD= 1.8%），100.7%（RSD=1.7%）。

2.2.6 供試品含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地的紅皮云杉針葉揮發(fā)油，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在2.2.4色譜條件下測(cè)定，并由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線計(jì)算10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油3種成分的含量，見表4。從中可知，不同產(chǎn)地樣品中樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯的含量均差異較大，最高達(dá)2～3倍以上。

表4 10批紅皮云杉針葉揮發(fā)油3種成分含量（mg/mL）

3 討論

3.1 目前色譜指紋圖譜的共有模式有兩種，即峰方式及全譜方式。鑒于紅皮云杉針葉揮發(fā)油在GC-MS測(cè)定下，所呈現(xiàn)的化學(xué)成分種類數(shù)目眾多，為了兼顧指紋圖譜的整體性和模糊性，采用了全譜方式來建立其共有模式并進(jìn)行指紋圖譜相似度的考察。

3.2 紅皮云杉針葉揮發(fā)油中樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯定量時(shí)，根據(jù)分析目的的不同，采用了與指紋圖譜測(cè)定不同的升溫程序。該條件下不僅目標(biāo)物的色譜行為滿足定量要求，并且分析時(shí)間相對(duì)較短。

3.3 紅皮云杉針葉揮發(fā)油的 GC-MS數(shù)據(jù)經(jīng)解析得知，該揮發(fā)油中不含有化合物萘，又基于萘的色譜保留時(shí)間和分子特性上滿足于作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的要求，故在樟腦、龍腦及乙酸龍腦酯定量時(shí)，采用萘作為內(nèi)標(biāo)物。

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Gas Chromatography-Mass Spectrometry Fingerprint of Volatile Oil in Picea koraiensis Nakai Leaves and Quantitative Analysis of Multiple Components

Zhao Hongbo1，Yu Miao1，Meng Fanying1，Su Rui2，Zong Ximing1，F(xiàn)ang Hongzhuang1（1 College of Pharmacy of Jiamusi University，Heilongjiang Jiamusi 154007，China；2 The First Hospital of Harbin City，Harbin 150010）

Objective:To establish an analysis method for the gas chromatograph-mass spectrometry（GC-MS）fingerprint and the content determination of multiple components of volatile oil in Picea koraiensis Nakai leaves.Methods:Fingerprint determinations of 10 lots of volatile oil of Picea koraiensis Nakai leaves from Heilongjiang Province were conducted and the contents of borneol，bornyl acetate and camphor were determined by using GC-MS technology with HP-5MS chromatographic column.Results:About 22 common peaks were confirmed in the fingerprints and the similarities of 10 lots of volatile oil of Picea koraiensis Nakai were higher than 0.90.The results of content determination demonstrated that some differences existed among camphor，borneol and bornyl acetate.Conclusion:The validation of systematic methodology showed that the method can be used for the identification of volatile oil of Picea koraiensis Nakai leaves and the evaluation of the quality of volatile oil.

Picea koraiensis Nakai；Gas Chromatography-Mass Spectrometry；Fingerprint；Content Determination of Multiple Components

10.3969/j.issn.1672-5433.2013.11.006

2012-06-21）

趙宏博，男，碩士。研究方向：中藥的活性成分和質(zhì)量控制。

方洪壯，男，教授。研究方向：計(jì)算藥物分析、中藥分析。通訊作者E-mail：fhz-chjms@sohu.com