H2O2對新生大鼠心室肌細(xì)胞HCN通道電流的影響及其機(jī)制

鄭明奇，劉 剛，董 梅，吉立雙，于 榛

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院心內(nèi)科，河北石家莊050031)

臨床和基礎(chǔ)研究表明，心臟病特別是氧化應(yīng)激條件下，例如心肌缺血和心肌梗死后，惡性心律失常事件的增加主要是由于離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍椎闹貥?gòu)明顯地改變了心肌細(xì)胞的興奮性和傳導(dǎo)。這種心肌電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞離子通道活性，表達(dá)以及功能上的顯著變化［1］。室性心律失常發(fā)生率的增加至少在部分是與超極化激活的環(huán)核苷酸門控通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel，HCN)蛋白表達(dá)和HCN 通道電流(funny current，If)密度的調(diào)控增加相關(guān)聯(lián)［1］。這種“功能獲得(gain of function)”的電重構(gòu)很可能通過希氏束-浦肯野系統(tǒng)的特殊傳導(dǎo)纖維增加異位的自動節(jié)律性［1］。但是，在疾病狀態(tài)下，心臟HCN通道活性/功能增強(qiáng)調(diào)控的機(jī)制尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 溶液與試劑

記錄全細(xì)胞If電流時(shí)，細(xì)胞外液和電極內(nèi)液參照文獻(xiàn)［2］。

各種蛋白激酶抑制劑(Sigma Aldrich 公司)。過氧化氫使用前溶解于雙蒸餾水，其余化學(xué)藥品溶于二甲基亞砜(DMSO)作為儲存液，實(shí)驗(yàn)時(shí)儲存液稀釋于細(xì)胞外液中，使DMSO 濃度均低于0.1%(不影響細(xì)胞膜離子通道功能)。用上述抑制劑進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)預(yù)處理1 h，然后記錄HCN 通道電流(If)。

1.2 新生大鼠心室肌細(xì)胞制備和細(xì)胞培養(yǎng)

本實(shí)驗(yàn)得到河北醫(yī)科大學(xué)倫理道德委員會批準(zhǔn)，1 ～3 d新生健康清潔級Wistar 大鼠(共5 批，每批8 只)購自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物合格證號:1202067)。心室肌細(xì)胞按照文獻(xiàn)所述制備［3］。上述所有細(xì)胞于37 ℃，95% CO2的孵育箱中培養(yǎng)以備膜片鉗實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)用。

1.3 全細(xì)胞電壓鉗和電流鉗記錄

室溫(20 ～23 ℃)條件下通過膜片鉗技術(shù)記錄If電流。記錄方法和數(shù)據(jù)分析參照文獻(xiàn)［3］。

1.4 Western blot 分析

來自心肌組織樣本的蛋白按照標(biāo)準(zhǔn)程序提取細(xì)胞膜蛋白［4］，使用酪氨酸特異性磷酸化抗體4G10，用Western blot 技術(shù)分析HCN 蛋白的定量表達(dá)。簡言之，以TE 緩沖液(10 mmol/L三羥甲基氨基甲烷甘油緩沖液，1 μg/mL 抑肽酶，2 mmol/L EDTA，pH 7.0)加1%曲通X-100 對心肌組織樣本進(jìn)行勻漿提取膜蛋白。使用試劑盒(皮爾斯)分析蛋白濃度。然后將所有檢測樣本蛋白等量加入在10%聚丙烯酰胺凝膠板上進(jìn)行電泳，然后轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯膜，后用TBST 洗膜5 min，3 次，用考馬斯亮藍(lán)染色后用水沖洗，經(jīng)5%牛奶TBS-T 加抗磷酸化HCN2 抗體4G10(1∶1 000稀釋)以分析HCN2 通道蛋白磷酸化活性。HCN2 蛋白信號通過增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光試劑(Pierce Chemical)，使用的UVP 生物成像系統(tǒng)進(jìn)行分析(Upland，CA)。將HCN2 蛋白除以β-actin 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用軟件(Pulse/PulseFit，V.8.11，HEKA Elektronik)采集并保存數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。變量方差分析和克萊默程序(Tukey-Kramer procedure)等用于多重比對，Student's t 檢驗(yàn)用于2 組數(shù)據(jù)間的比較。

2 結(jié)果

2.1 H2O2 對新生大鼠心室肌細(xì)胞If 電流的影響

H2O2處理前后的心室肌細(xì)胞If通道電流(圖1)。從－40 mV的保持電位至測試電位－130 mV使膜超極化得到激活的If電流。100 μmol/L H2O2處理30 min 后，If電流顯著增加，伴隨著對應(yīng)的電導(dǎo)增大(Gmax)，激活曲線的半數(shù)激活電壓(V1/2)向除極化方向移動，激活速度(時(shí)間常數(shù)，τact)增快。

2.2 酪氨酸蛋白激酶對H2O2 增大If 電流的影響

Genistein 或PP2 明顯抑制H2O2增大的If電流(圖2A);與之相一致的是，H2O2增大的HCN2 通道酪氨酸磷酸化水平也被Genistein 或PP2 明顯抑制(P＜0.05)。

2.3 蛋白酪氨酸磷酸酶對If 電流的影響

兩種非特異性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)抑制劑PAO(1 μmol/L)或者Na3VO4(10 μmol/L)均明顯增大If電流密度［對照組:(4.7 ± 0.6)pA/pF;PAO 組:(11.7 ± 1.1)pA/pF;Na3VO4組(12.0 ±2.1)pA/pF;P＜0.05］(圖3)。

2.4 硫氧還原蛋白系統(tǒng)對H2O2 增大的If 電流的影響

硫氧還原蛋白受體抑制劑金諾芬(auranofin 10 μmol/L)或13-cis-RA(100 μmol/L)明顯抑制H2O2作用下增大的If電流(圖4)。

3 討論

氧化應(yīng)激條件下心臟病患者發(fā)生心律失常內(nèi)在機(jī)制主要是心肌電重構(gòu)，這種心肌電重構(gòu)主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞離子通道活性，表達(dá)以及功能上的顯著變化。本研究使用外源性H2O2顯著增大了新生大鼠心室肌If電流，并且這種電流的增大與其編碼的通道蛋白磷酸化水平顯著增高密切相關(guān)。為探討酪氨酸蛋白激酶在H2O2調(diào)控If電流增大機(jī)制中的作用，使用非特異性酪氨酸蛋白激酶抑制劑Genistein或者c-Src 蛋白特異抑制劑PP2 顯著抑制了H2O2對If電流的增大作用，增大的HCN 通道的酪氨酸磷酸化水平也被顯著抑制，暗示了酪氨酸激酶在氧化應(yīng)激刺激下HCN 通道重構(gòu)機(jī)制中的重要角色。

作為一個(gè)對心肌重構(gòu)起重要作用的因素，氧化應(yīng)激能夠引起細(xì)胞蛋白氧化還原狀態(tài)的可逆或不可逆改變［5－6］。在心肌疾病狀態(tài)下，氧化應(yīng)激誘發(fā)的氧化還原狀態(tài)失衡促進(jìn)了關(guān)鍵調(diào)控蛋白的氧化損傷，明顯地影響了心肌功能。我們以前的研究已經(jīng)報(bào)道了Trx 系統(tǒng)在心衰大鼠心臟有顯著性減弱，這種條件下心肌的電重構(gòu)是由于細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的轉(zhuǎn)換而引起的，這種氧化應(yīng)激引起Kv 通道的重構(gòu)能夠通過激活心肌細(xì)胞內(nèi)的Trx 系統(tǒng)被逆轉(zhuǎn)［4，7－8］。為進(jìn)一步探討硫氧還原蛋白系統(tǒng)是否介導(dǎo)了外源性氧化因子H2O2調(diào)控增大If電流的機(jī)制，本研究用硫氧還原蛋白受體抑制劑金諾芬或13-cis-RA 均明顯抑制H2O2作用下增大的If電流，暗示了硫氧還原蛋白(Trx)系統(tǒng)在調(diào)控氧化應(yīng)激刺激下HCN 通道重構(gòu)機(jī)制的中樞作用。

疾病狀態(tài)下氧化應(yīng)激在細(xì)胞和分子水平領(lǐng)域的研究近10年來在國際上和國內(nèi)不斷得到創(chuàng)新發(fā)展［4－8］。在缺血和衰竭心臟，氧化應(yīng)激通過細(xì)胞內(nèi)Trx 系統(tǒng)介導(dǎo)心肌細(xì)胞離子通道重構(gòu)的研究對于預(yù)防和逆轉(zhuǎn)以心肌電重構(gòu)為基礎(chǔ)的心律失常是一個(gè)全新的方向和突破。本研究顯示在氧化劑H2O2刺激下的心室肌細(xì)胞If電流增大，是通過活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)依存性的酪氨酸蛋白激酶和硫氧還原蛋白系統(tǒng)，調(diào)控HCN 通道的活性和表達(dá)，本研究為氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷和離子通道重構(gòu)的調(diào)控研究提供了一個(gè)新視點(diǎn)，為臨床更有效地防治心律失常提供新的理論依據(jù)和治療策略。

［1］Amoundas AA，Wu R，Juang G，et al．Electrical and structure remodeling of the failing ventricle［J］．Pharm Ther，2010，92:213－230．

［2］Wang Y，Morishima M，Zheng MQ，et al．Transcription factor Csx/Nkx2.5 and GATA4 distinctly regulate expression of Ca2+channels in neonatal rat heart［J］．J Mol Cell Cardiol，2007，42:1045－1053．

［3］Zheng MQ，Wang Y，Kang L，et al．Intracellular Ca2+-and PKC-dependent upregulation of T-type Ca2+channels in LPC-stimulated cardiomyocytes［J］．J Mol Cell Cardiol，2010，48:131－139．

［4］Tang K，Li X，Zheng MQ，et al．Role of ASK1-JNK-p38 signaling in Kv channel remodeling of the failing heart:regulation by thioredoxin［J］．Antioxid Redox Signal，2011，14:25－35．

［5］Powis G，Montfort WR．Properties and biological activities of thioredoxins［J］．Ann Rev Pharmacol Toxicol，2001，41:261－295．

［6］Nordberg J，Arner ES．Reactive oxygen species，antioxidants，and the mammalian thioredoxin system［J］．Free Rad Biol Med，2001，31:1287－1312．

［7］Zheng MQ，Tang K，Zimmerman MC，et al．Role of {gamma}-glutamyl transpeptidase in redox regulation of K+channel remodeling in post-myocardial infarction rat hearts［J］．Am J Physiol Cell Physiol，2009，297:C253－262．

［8］Li S，Zheng MQ，Rozanski GJ．Glutathione homeostasis in ventricular myocytes from rat hearts with chronic myocardial infarction［J］．Exp Physiol，2009，94:815－824．