響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須中蘆丁的提取工藝及檢測

趙海福，魏彥明，董曉寧，王廷璞，趙 強，劉文博

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070； 2.天水師范學(xué)院生命科學(xué)與化學(xué)學(xué)院，甘肅 天水 741001；3.新疆大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046)

玉米(Zeamays)須為玉米的花柱和柱頭[1]。玉米在我國種植廣泛，玉米須為玉米的主要副產(chǎn)品之一，富含揮發(fā)油、皂苷、黃酮類、多糖、尿囊素和有機酸等多種對人體有益的化學(xué)成分，具有利尿、降血糖、降壓、抑菌、增強免疫以及抗癌等功效[2-4]。玉米須中富含的黃酮類物質(zhì)有抗氧化、抗病毒等作用，可有效清除機體內(nèi)的超氧陰離子和羥基自由基[5-8]。

蘆丁作為黃酮類中最為常見的一種化合物，具有與黃酮類化合物相近的性質(zhì)和功能。玉米須作為天然原材料，從其中提取藥物更安全，因此，研究從玉米須中提取蘆丁有實用性、經(jīng)濟性和時代需求性。目前，國內(nèi)外均以研究玉米須中的黃酮為主，少有以蘆丁為研究對象的報道，因此，本研究選取蘆丁進行研究。索氏回流法具有能用少量溶劑連續(xù)循環(huán)提取的特點，乙醇是最常用的廉價安全溶劑而超聲波具有粉碎細胞的能力。賈雪峰[9]在提取苦蕎麥(Fagopyrumtataricum)中的蘆丁時選用不同體積分數(shù)的乙醇作為提取劑，效果明顯。因此，本試驗選用乙醇為溶劑，采用超聲振蕩處理輔助索氏回流法提取玉米須中的蘆丁。

本試驗在單因素水平篩選的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法中心組合試驗設(shè)計[10-12]，對玉米須中蘆丁的提取工藝條件進行了優(yōu)化，并用紫外、紅外光譜和高效液相色譜(HPLC)對提取物成份及純度進行檢測，以期為玉米須的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料 新鮮玉米須，采自甘肅省臨洮縣衙下鎮(zhèn)，經(jīng)自然風(fēng)干、粉碎后過0.180 mm篩。

1.1.2試劑 蘆丁標準品(國藥集團化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn))，乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、甲醇、3%硼砂、石灰水、鹽酸、磷酸等均為分析純試劑。

1.1.3儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(安捷倫)、UV751-GD紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、RE52-99旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、紫外可見光光度計(Lambda 35型，Perkin Elmer Precisely)、數(shù)控超聲波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超聲儀器有限公司)、FA22048電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、傅立葉變換紅外光譜儀(Spectrum one B型，Perkin Elmer Precisely產(chǎn)品)、 SHB-Ⅳ雙A 循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)、瑪瑙研缽、石英比色皿。

1.2試驗方法

1.2.1蘆丁標準工作曲線的繪制 準確稱取0.200 8 g蘆丁標準品，溶解后移入100 mL容量瓶中，定容、搖勻，稀釋至體積為原來的1.5倍，得到質(zhì)量濃度為1.34g·L-1的蘆丁標準溶液。分別移取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00和8.00 mL置于50 mL容量瓶中，并分別加入5.0 mL 5%的NaNO2溶液，6 min后加入10.0 mL 1%的Al(NO3)3溶液，再6 min后加入20.0 mL 4%的NaOH溶液，15 min后定容、搖勻，得到質(zhì)量濃度分別為0.026 8、0.053 6、0.080 8、0.107 2、0.134 0、0.160 8、0.187 6和0.214 4 mg·mL-1的蘆丁梯度溶液，以雙重蒸餾水為參比，在510 nm處測定其吸光度值，繪制濃度-吸光度值標準曲線。

1.2.2玉米須蘆丁樣液的制備 準確稱取干燥的玉米須粉末8.0 g，按設(shè)計時間浸泡，在不同的溫度與功率下超聲振蕩處理。采用索氏回流法提取玉米須中的蘆丁。將提取液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓濃縮至無醇味后轉(zhuǎn)入100 mL錐形瓶，加入少許活性炭脫色，靜置過夜，抽濾，將濾液按編號裝入容量瓶，并定容至50 mL，靜置待測定。

1.2.3蘆丁含量的測定 將樣液用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法處理后，在510 nm處測定吸光度值，對照標準曲線，計算玉米須中蘆丁的含量[13-15]。

式中，C為提取物中蘆丁含量(mg·mL-1)，V為體積(mL)，B為稀釋倍數(shù)，m為玉米須的質(zhì)量(g)。

1.2.4玉米須中蘆丁的提取工藝 選取乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間、索氏回流時間、浸泡時間、超聲溫度、超聲功率和浸提液pH值8個因素依次進行單因素提取試驗[15]。各因素的水平梯度設(shè)置的乙醇體積分數(shù)分別為35%、40%、45%、50%、55%、60%和65%；液料比(mL·g-1)為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1和40∶1；超聲時間為20、25、30、35、40、45和50 min；回流時間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0和3.5 h；浸泡時間為0、6、12、18、24、30和36 h；超聲溫度為30、35、40、45、50、55和60 ℃；超聲功率為200、250、300、350、400、450和500 W；浸提液pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0。采用極差分析法篩選出4個主要因素，然后按照響應(yīng)面法進行蘆丁提取，最后建立玉米須中蘆丁的提取工藝。

在此工藝下同法制備蘆丁樣液，用9%的鹽酸調(diào)節(jié)樣液pH值至3～4，靜置過夜，自然冷卻析晶后得蘆丁粗品。將蘆丁粗品用150 mL蒸餾水溶解于250 mL燒杯中，加熱，攪拌，再加入3%的硼砂溶液5 mL，用飽和石灰水調(diào)節(jié)pH值為8～9，煮沸至粗品溶解后，趁熱減壓抽濾，將濾液用9%的鹽酸調(diào)節(jié)pH值為3～4，靜置過夜，析出晶體，得蘆丁樣品。

1.2.5玉米須蘆丁樣品的分析

1)紫外光譜分析：用甲醇做空白對照，選擇波長范圍為190～450 nm，采用Lambda 35型紫外可見光光度計，對蘆丁樣品進行測定分析[16]。

2)紅外光譜分析：準確稱取2 mg蘆丁樣品和300 mg KBr錠劑，在瑪瑙研缽中混合均勻并研磨。取200 mg已研磨的混合物，用錠劑成型器制成薄片，選取吸收頻率范圍為450～4 000 cm-1，采用Spectrum One傅立葉紅外光譜儀，對蘆丁樣品進行檢測[16]。

3)高效液相色譜法分析

①色譜條件為色譜柱：Zorbax eclipse XDB C18柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-0.2%磷酸溶液(65∶35)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：254 nm；溫度：30±1 ℃；進樣量：20 μL[17]。

②HPLC測定的工作曲線的繪制：準確配制質(zhì)量濃度為0.025 mg·mL-1的蘆丁標準液，靜置備用。將其依次配成質(zhì)量濃度為0.188、0.375、0.750、1.500和3.000 μg·mL-1的蘆丁梯度溶液，進行HPLC檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1蘆丁標準曲線 根據(jù)蘆丁標準品系列質(zhì)量濃度梯度在510 nm處測定的吸光值，得回歸方程：Y=3.935 5X+0.006 3(R2=0.991 3，n=8)，在0.02～0.25 mg·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。

2.2單因素試驗結(jié)果 根據(jù)單因素的試驗結(jié)果(表1)，以蘆丁含量為指標，選出每個因素的最優(yōu)水平，即對應(yīng)的蘆丁含量最高。

2.3響應(yīng)面法優(yōu)化的工藝條件

2.3.1響應(yīng)面試驗因素水平的選擇 對單因素試驗結(jié)果進行極差分析，最終選取乙醇體積分數(shù)、液料比、回流時間和超聲時間4個因素為自變量，玉米須蘆丁含量為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面分析法設(shè)計，進行4因素3水平的響應(yīng)面試驗(表2)，以優(yōu)化玉米須蘆丁的提取工藝[15]。每組試驗3次重復(fù)。

表1 單因素試驗結(jié)果Table 1 Results of the single factor experiment

表2 響應(yīng)面試驗因素水平Table 2 Factor level of response surface

2.3.2中心組合試驗結(jié)果 采用Design-Expert 7.0分析軟件，以玉米須蘆丁含量為指標，利用Box-Behnken中心設(shè)計原理[10-12]，以蘆丁的含量為響應(yīng)值，影響其含量的4個主要因素A(乙醇體積分數(shù))、B(液料比)、C(回流時間)和D(超聲時間)為自變量，進行4因素3水平的Box-Behnken中心組合設(shè)計(表3)。

表3中1～24是析因試驗，25～29是中心試驗，29個試驗點分別為析因點和零點，其中析因點為A、B、C和D所構(gòu)成的三維空間的頂點，零點為區(qū)域的中心點，中心試驗3次重復(fù)。

2.3.3不同因素對玉米須蘆丁含量的影響 采用RSA程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進行響應(yīng)面分析，得到4個因子與玉米須蘆丁含量的回歸方程：

Y=12.956 8+0.268 3A+0.658 8B-0.878 4C+0.356 1D-0.982 8AB-0.114 3AC+0.788 8AD+0.079 5BC-0.448 5BD-0.546 0CD-1.817 4A2-2.2902B2-1.586 9C2-1.746 4D2.

并對回歸模型進行方差分析(表4)。

分析結(jié)果表明，影響因素與回歸方程的關(guān)系達到極顯著水平(P<0.01)，失擬項也達到極顯著水平(P<0.01)，說明該回歸方程與實際情況相符(R2=0.858 2)，因此可以用該方程對試驗結(jié)果進行分析。各因素之間的影響存在一定互作，而不是簡單的線性關(guān)系，其中A2、B2、C2、D2極顯著(P<0.01)，C顯著(P<0.05)，其余互作均不顯著(P>0.05)(表4)。

表3 響應(yīng)面設(shè)計及試驗結(jié)果Table 3 RSD and results

表4 響應(yīng)面試驗方差分析Table 4 Variance analysis of response surface

一次項(P=0.353 5)為不顯著項，表明各因素與響應(yīng)值不只是簡單的線性關(guān)系。從單因素水平來看，各因素對玉米須蘆丁提取率的影響依次為：回流時間>液料比>超聲時間>乙醇體積分數(shù)。而二次項(P=0.000 3)為高度顯著項，在有互作的情況下，各因素與響應(yīng)值的關(guān)系是卷曲的；對玉米須蘆丁提取率的影響順序為AB>AD>CD>BD>AC>BC(表4)。

2.3.4響應(yīng)面最佳工藝條件的確定 根據(jù)響應(yīng)方程繪制的響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，響應(yīng)面圖形能直觀地反映各因素和它們之間的互作對響應(yīng)值的影響。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值Y與試驗因素A、B、C和D相對應(yīng)構(gòu)成的三維曲線圖，具體做法是將兩個因素固定在零水平，然后再做剩下的兩個因素交互作用的響應(yīng)面曲線圖(圖1)。

從各因素之間的等高線圖和響應(yīng)面圖可知，其曲線走勢的坡度越陡，影響越顯著；坡度越平滑，影響越小。由Design-Expert 7.0軟件的系統(tǒng)分析結(jié)果得出，影響玉米須蘆丁含量的最佳提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)49.09%、液料比30.72 mL∶1 g、回流時間1.73 h以及超聲時間35.86 min，在該條件下蘆丁的得率為12.71 mg·g-1。結(jié)合實際操作過程，考慮相關(guān)的局限性，對此最佳工藝進行修正，修正后的工藝條件為乙醇體積分數(shù)49%、液料比30 mL∶1 g、回流時間1.7 h以及超聲時間36 min，在該工藝條件下，玉米須蘆丁的得率為12.223 mg·g-1，3次重復(fù)的結(jié)果分別為12.143、12.285、12.029 mg·g-1，取平均值為12. 152 mg·g-1，與理論值的誤差為0.93%，這說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化的模型能夠較好地預(yù)測實際玉米須中蘆丁的含量，并且得出的提取工藝條件較為理想。

2.4玉米須提取物的檢測

2.4.1紫外光譜檢測 將玉米須提取物進行紫外光譜檢測，樣品在211.36 nm處有比較尖銳的吸收峰，表明樣品含有-OH、-OCH3或兩個以上雙鍵的共軛體；在258.62 nm處也有明顯的吸收峰，表明樣品有苯基或苯氧基結(jié)構(gòu)；而樣品在362.65 nm處出現(xiàn)的包峰不表示任何生色基團(圖2)。以上數(shù)據(jù)與純品蘆丁檢查結(jié)果及文獻報道相一致[16-19]。

圖1 各因素交互作用的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.1 Contour map and response surface graph between various factors interaction effects

圖2 紫外光譜檢測結(jié)果Fig.2 Result of UV-spectra

2.4.2紅外光譜檢測 將玉米須提取物進行紅外光譜檢測(圖3)，對紅外光譜圖進行解析可知，樣品在1 655.52、1 600.37、1 506.68和1 456.88 cm-1等處有多個吸收峰，這表明是苯環(huán)π鍵共扼體系的C=C鍵伸縮振動的存在引起的振動吸收峰和α、β-不飽和羰基化合物的伸縮振動吸收峰；在3 336.91 cm-1處出現(xiàn)較寬的吸收峰，這表明是可成氫鍵的-OH、配位水或為醇和酚的羥基的伸縮振動產(chǎn)生的吸收峰；1 456.88 cm-1是-CH3的彎曲振動或是-CH2的剪切式振動產(chǎn)生的吸收峰；而947.39、921.78、879.34、808.27、728.76和657.14 cm-1等處的多個吸收峰，則為芳環(huán)的特征頻率吸收；1 169.25 cm-1是醚的C-O-C伸縮振動吸收峰，1 967.54 cm-1是積累雙鍵；1 420～1 300 cm-1是烯烴的C-H面內(nèi)彎曲振動，1 000～670 cm-1是烯烴的C-H面外彎曲振動。由分析結(jié)果可知，實驗所測得的數(shù)據(jù)與純品蘆丁檢查結(jié)果及文獻報道相一致[16-19]，這表明本實驗所的最佳工藝下提取的樣品富含蘆丁，實驗所得的最佳提取工藝可靠的。

2.4.3HPLC檢測 選定波長為254 nm，將蘆丁標準品與響應(yīng)面優(yōu)化條件下提取的蘆丁樣品分別進行HPLC檢測(圖4)。將蘆丁標準系列得到的標準曲線作為色譜峰面積Y，對進樣濃度進行線性回歸分析可得：Y=70.299X-8.709 9(R2=0.999 2)，范圍為0.375～25 μg·mL-1；蘆丁標準品保留時間t=9.625 min，范圍為9.310～11.032 min。優(yōu)化條件下提取的蘆丁樣品在9.457 min時出峰，峰形對稱，且與標樣接近。平均回收率為99.58%、RSD為2.4%，表明精密度良好、重現(xiàn)性好。

圖3 紅外光譜檢測結(jié)果Fig.3 Result of infrared-spectra

圖4 HPLC檢測結(jié)果Fig.4 Result of HPLC

3 結(jié)論

與常規(guī)的溶劑浸提法、滲漉法、煎煮法或回流提取法等相比較，超聲波輔助索氏回流法提取玉米須中的蘆丁具有更好的經(jīng)濟實用性和易操作性，同時還可以縮短提取時間，節(jié)省能量。由于超聲波用于細胞內(nèi)部活性成分的提取具有常規(guī)方法不可比擬的優(yōu)勢，因此，超聲波輔助索氏回流法具有很高的應(yīng)用價值。

試驗以單因素篩選為基礎(chǔ)，將Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計的響應(yīng)面法與超聲波振蕩輔助和索氏回流相結(jié)合，將其應(yīng)用于優(yōu)化玉米須中蘆丁提取工藝的研究。結(jié)果表明，該工藝對玉米須中蘆丁的提取影響顯著。此外，本研究還指出了乙醇體積分數(shù)、液料比、回流時間以及超聲時間在玉米須中蘆丁提取過程中的影響不是簡單的線性關(guān)系。因此，響應(yīng)面設(shè)計比正交設(shè)計在本類試驗中更具優(yōu)越性[20]。目前正交試驗設(shè)計法雖然已被廣泛用于各種藥用植物有效成分的提取工藝中，但正交設(shè)計只能處理離散水平值，在實際應(yīng)用中還存在諸多局限性[21]。響應(yīng)面試驗設(shè)計法是用一個多元二次回歸方程，擬合試驗中多個因子與響應(yīng)值間的關(guān)系，估計回歸方程的系數(shù)[22-24]，通過對方程求極值來達到參數(shù)優(yōu)化的目的。

本研究通過單因素篩選考察了乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間、回流時間、浸泡時間、超聲溫度、超聲功率和浸提液pH值8組影響蘆丁含量的因素，將經(jīng)過極差分析確定的4組最佳單因素進行響應(yīng)面試驗，對玉米須中蘆丁提取的最佳條件進行了優(yōu)化，確定了其最佳工藝的提取條件，即：乙醇體積分數(shù)49%、液料比30 mL∶1 g，回流時間1.7 h以及超聲時間36 min。在該工藝條件下，玉米須蘆丁的得率為12.152 mg·g-1。通過紅外、紫外光譜檢測以確定提取物的結(jié)構(gòu)，用HPLC檢測進一步驗證響應(yīng)面法提取工藝的可靠性。經(jīng)檢驗證明，該模型合理可靠，能夠較好地預(yù)測試驗結(jié)果，能有效減少工藝操作的盲目性，為進一步的放大試驗研究奠定基礎(chǔ)，對玉米產(chǎn)業(yè)的深加工提供了一定的理論指導(dǎo)。

玉米在我國分布廣泛，而玉米須富含黃酮，有清熱、消腫、降三高、提高機體免疫力等功效。本試驗主要對甘肅省隴中地區(qū)玉米中蘆丁的響應(yīng)面提取工藝及檢測方法進行了系列研究，為玉米須這一藥物資源的深層次開發(fā)和利用提供了一定的試驗依據(jù)。

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