Cu2+脅迫對(duì)象草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的抑制

王小玲，劉騰云，高 柱，余發(fā)新，王碧琴

(江西省科學(xué)院生物資源研究所 江西省重金屬污染生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌330029)

近年來(lái)，環(huán)境污染和生態(tài)破壞日益嚴(yán)峻，嚴(yán)重影響到人類的健康和生存，其中重金屬對(duì)環(huán)境的污染和破壞尤為嚴(yán)重[1]。Cu是動(dòng)植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的一種微量元素，也是具有一定微量元素功能的毒性元素，會(huì)在高濃度時(shí)對(duì)植物或微生物產(chǎn)生毒害[2-3]。Cu在環(huán)境中的含量一般較低，在非污染土壤和沉積物中為10～30 mg·kg-1，在非污染自然水體中低于2 mg·L-1。江西省環(huán)境保護(hù)局公布的數(shù)據(jù)顯示，江西省土壤重金屬Cu元素的背景值為20.8 mg·kg-1。然而，受采礦和冶煉工業(yè)的影響，礦區(qū)周圍和附近流域的土壤存在重金屬污染或潛在污染，優(yōu)勢(shì)水稻區(qū)域土壤中Cu含量最高達(dá)67.0 mg·kg-1，德興銅礦區(qū)土壤Cu平均含量高達(dá)186.5 mg·kg-1，一些典型地區(qū)農(nóng)田土壤中含Cu量最高可達(dá)3 755 mg·kg-1[4]。當(dāng)重金屬Cu在土壤中積累到一定程度時(shí)，就會(huì)對(duì)土壤-植物系統(tǒng)產(chǎn)生毒害和破壞作用，對(duì)植物生長(zhǎng)、產(chǎn)量和品種均有較大危害，特別是被農(nóng)作物吸收富集進(jìn)入食物鏈后，會(huì)損害動(dòng)物和人類的健康[5-6]。

象草(Pennisetumpurpureum)又名紫狼尾草，是熱帶和亞熱帶地區(qū)廣泛栽培的一種多年生高產(chǎn)牧草，也是我國(guó)南方飼養(yǎng)畜禽的重要青綠飼料。近年來(lái)，許多地方都有種植象草作為能源植物的報(bào)道[7]。象草適應(yīng)性較強(qiáng)、生長(zhǎng)迅速、生物量大且營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高[8]，在作為良種牧草及食用菌栽培原料[9]方面研究成果較多，但迄今尚鮮見其在重金屬污染土壤防治方面利用的報(bào)道。種子萌發(fā)是植物生長(zhǎng)的起點(diǎn)，也是對(duì)外界環(huán)境響應(yīng)敏感的階段，因此，本研究分析不同濃度Cu2+脅迫對(duì)象草發(fā)芽率及幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為熱帶和亞熱帶地區(qū)Cu污染土壤中種植象草的適應(yīng)性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1供試材料 供試材料為禾本科象草種子，購(gòu)于浙江虹越花卉有限公司。用分析純CuSO4·5H2O做培養(yǎng)液中Cu的來(lái)源，濃度以Cu2+計(jì)。試驗(yàn)于2012年3-8月在江西省觀賞植物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1種子預(yù)處理 隨機(jī)取一定量種子，剔除雜質(zhì)及癟種，挑選出飽滿一致的種子。先用自來(lái)水沖洗干凈，再用蒸餾水浸泡2 h，然后用0.5%的高錳酸鉀溶液表面消毒15 min，最后用蒸餾水沖洗干凈，待用。

1.2.2溶液配制 稱取一定量的CuSO4·5H2O配成100 mg·L-1的原液(以Cu2+的濃度計(jì))，依次稀釋成80、40、20和10 mg·L-1的溶液待用。

1.2.3脅迫處理 取待用種子，均勻擺放在鋪有雙層無(wú)菌定性濾紙，直徑為10 cm的帶蓋培養(yǎng)皿中，每皿均勻擺放30粒。各培養(yǎng)皿分別加入10、20、40、80和100 mg·L-1的Cu2+溶液5 mL，等量蒸餾水作對(duì)照。放在溫度為(28±2) ℃，光照為12 h·d-1、光照強(qiáng)度10 000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每12 h用稱量法加水一次，每處理3次重復(fù)。萌發(fā)試驗(yàn)在培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，將萌發(fā)2 d后的種子幼苗各個(gè)在不同濃度Cu2+處理溶液中水培7 d，之后測(cè)定幼苗各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3測(cè)定指標(biāo)和方法

1.3.1發(fā)芽率 12 h后，開始觀察發(fā)芽情況，以后每3 h統(tǒng)計(jì)一次發(fā)芽數(shù)，第18小時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽勢(shì)，第27小時(shí)統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率，并計(jì)算發(fā)芽指數(shù)。

發(fā)芽率=27 h內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

相對(duì)發(fā)芽率=Cu2+脅迫處理發(fā)芽率/對(duì)照發(fā)芽率×100%；

發(fā)芽勢(shì)=18 h內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%；

相對(duì)發(fā)芽勢(shì)= Cu2+脅迫處理發(fā)芽勢(shì)/對(duì)照發(fā)芽勢(shì)×100%；

發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt；

活力指數(shù)VI=GI×S；

抑制率=(對(duì)照指標(biāo)值-處理指標(biāo)值)/對(duì)照指標(biāo)值×100%。

式中，Gt為在t日的發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)，S為幼苗高度。

1.3.2胚芽鞘長(zhǎng)度測(cè)量 萌發(fā)20 h后，胚芽鞘伸長(zhǎng)至20～30 mm，切取5 mm胚芽鞘于各濃度梯度Cu2+處理培養(yǎng)皿中，等量蒸餾水作對(duì)照，每皿9段，每處理3次重復(fù)，于28 ℃下避光培養(yǎng)，分別在24、48、72和96 h時(shí)測(cè)量芽鞘切段長(zhǎng)度。

1.3.3幼苗根長(zhǎng)、苗高、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的測(cè)量 每處理隨機(jī)挑選10株幼苗，先用電子游標(biāo)卡尺分別測(cè)量根長(zhǎng)和苗高，再用電子天平測(cè)其鮮質(zhì)量，最后用錫箔紙包好于105 ℃殺青30 min后80 ℃烘至質(zhì)量恒定，冷卻稱干質(zhì)量。

1.4數(shù)據(jù)分析法 采用Sigmaplot 10.0和SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理及相關(guān)方差分析(ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1Cu2+脅迫對(duì)象草種子萌發(fā)的影響 各處理種子前18 h發(fā)芽率升高迅速，18 h后增幅逐漸變緩(圖1)。前18 h，10、20和40 mg·L-1處理的發(fā)芽率均大于對(duì)照，80和100 mg·L-1處理發(fā)芽率低于對(duì)照，推測(cè)該現(xiàn)象與高濃度時(shí)象草為適應(yīng)逆境條件使種子發(fā)育變緩有關(guān)。18 h后，發(fā)芽率先隨著Cu2+脅迫的增加而升高，40 mg·L-1處理發(fā)芽率達(dá)最大(95%)，之后隨Cu2+濃度繼續(xù)增加發(fā)芽率逐漸降低，80 mg·L-1處理發(fā)芽率(88%)雖低于40 mg·L-1，卻明顯高于對(duì)照(79%)。

圖1 Cu2+對(duì)象草發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of Cu2+ on germination percentage of Pennisetum purpureum

除100 mg·L-1Cu2+的處理外，其它處理相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)均大于對(duì)照(圖2)。當(dāng)Cu2+濃度從10 mg·L-1增加到40 mg·L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)同時(shí)達(dá)到最高，分別為130%、120%，當(dāng)Cu2+濃度繼續(xù)升高到80 mg·L-1時(shí)，相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)分別降低到114%、111%。從相對(duì)發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽勢(shì)的變化規(guī)律可看出，象草種子萌發(fā)對(duì)重金屬Cu2+具一定耐性。

Cu2+濃度10～40 mg·L-1時(shí)，象草種子發(fā)芽指數(shù)高于對(duì)照，Cu2+濃度≥80 mg·L-1則低于對(duì)照。各濃度象草種子活力指數(shù)均低于對(duì)照，且隨濃度升高呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(表1)。

圖2 Cu2+對(duì)象草相對(duì)發(fā)芽勢(shì)和相對(duì)發(fā)芽率的影響Fig.2 Effects of Cu2+ on relative germination energy and relative germination percentage of Pennisetum purpureum

表1 Cu2+對(duì)象草發(fā)芽指數(shù)及活力指數(shù)的影響Table 1 Effects of Cu2+ on germination index and vigor index of Pennisetum purpureum

2.2Cu2+脅迫對(duì)5 mm胚芽鞘的影響 不同Cu2+濃度處理的5 mm象草胚芽鞘，在24、48、72和96 h時(shí)，不存在生長(zhǎng)停頓或枯萎現(xiàn)象(圖3)。低于80 mg·L-1的胚芽鞘生長(zhǎng)速度高于對(duì)照，說(shuō)明低濃度Cu2+脅迫對(duì)象草生長(zhǎng)存在一定的促進(jìn)作用，當(dāng)濃度在80～100 mg·L-1時(shí)胚芽鞘生長(zhǎng)低于對(duì)照，說(shuō)明高濃度Cu2+脅迫對(duì)象草生長(zhǎng)存在抑制作用，且強(qiáng)度隨濃度增加而增強(qiáng)。其中20 mg·L-1處理24 h和48 h時(shí)，胚芽鞘最長(zhǎng)，分別達(dá)6.58和6.99 mm，40 mg·L-1處理72 h和96 h后胚芽鞘長(zhǎng)度達(dá)最大值，分別為7.86和8.08 mm。由此可知，低濃度Cu2+脅迫(< 80 mg·L-1)對(duì)胚芽鞘生長(zhǎng)不存在抑制效應(yīng)，象草能夠較好生長(zhǎng)，較高濃度Cu2+脅迫(≥ 80 mg·L-1)可抑制象草生長(zhǎng)。

圖3 Cu2+對(duì)象草5 mm胚芽鞘長(zhǎng)度的影響Fig.3 Effects of Cu2+ on 5 mm length coleoptile of Pennisetum purpureum

2.3Cu2+脅迫對(duì)象草幼苗生長(zhǎng)的影響 Cu2+處理對(duì)象草的苗高和根長(zhǎng)表現(xiàn)出一定的抑制作用，并隨濃度升高苗高和根長(zhǎng)生長(zhǎng)量均表現(xiàn)出降低趨勢(shì)(表2)。

從第3天開始，隨Cu2+濃度增加，幼苗從葉尖到基部逐漸由白亮變成微黃，直至葉片全部變成黃色、脫落。從第4天開始，隨Cu2+濃度的增加，幼苗根逐漸萎縮變黑，在高濃度條件下(80～100 mg·L-1)，幾乎看不到正常發(fā)育的幼根，根生長(zhǎng)點(diǎn)已嚴(yán)重破壞，出現(xiàn)畸形甚至腐爛。由此說(shuō)明，Cu2+對(duì)象草的抑制作用是從根開始的，通過(guò)抑制根的生長(zhǎng)進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)(圖4)。

表2 Cu2+對(duì)象草苗高及根長(zhǎng)的影響Table 2 Effects of Cu2+ on seedling height and root length of Pennisetum purpureum

圖4 Cu2+脅迫處理后第7天的象草幼苗形態(tài)Fig.4 Cu2+ stress treatment on seedling morphology of Pennisetum purpureum in the 7th day

Cu2+脅迫顯著降低象草的鮮、干質(zhì)量(圖5)。10 mg·L-1時(shí)，象草幼苗的平均鮮、干質(zhì)量分別為對(duì)照的77%、81%，與對(duì)照差異不顯著，但20、40、80和100 mg·L-1單株鮮、干質(zhì)量顯著低于對(duì)照(P<0.05)，鮮質(zhì)量分別為對(duì)照的54%、41%、30%和25%，干質(zhì)量分別為對(duì)照的60%、51%、37%和33%。

2.4Cu2+濃度與抑制率的回歸分析 象草苗高、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的抑制率與Cu2+濃度顯著正相關(guān)(P<0.05)(圖6、7)。Cu2+污染對(duì)象草根長(zhǎng)抑制率明顯高于苗高，對(duì)鮮質(zhì)量和干質(zhì)量抑制率差異不明顯。Cu2+脅迫下對(duì)根長(zhǎng)的抑制作用大于苗高，表明Cu2+最先影響到根系生長(zhǎng)，再遷移到地上部分，進(jìn)而影響幼苗高度。

3 討論與結(jié)論

重金屬離子脅迫會(huì)影響草種萌發(fā)，進(jìn)而對(duì)其生產(chǎn)產(chǎn)生影響。多立安等[10]發(fā)現(xiàn)，高濃度Cd和Pb抑制多年生黑麥草種子的萌發(fā)，而Cu和Zn抑制作用較小。王瀚等[11]在Cu脅迫條件下發(fā)現(xiàn)，蘿卜種子的萌發(fā)并不表現(xiàn)出劑量依賴效應(yīng)。象草種子萌發(fā)過(guò)程中，當(dāng)Cu2+處理濃度小于80 mg·L-1時(shí)，促進(jìn)萌發(fā)，高于80 mg·L-1時(shí)，抑制萌發(fā)。這與重金屬在較低濃度下刺激種子萌發(fā)和高濃度下抑制種子萌發(fā)[12]的結(jié)論一致。

圖5 Cu2+對(duì)象草幼苗鮮、干質(zhì)量的影響Fig.5 Effects of Cu2+ on fresh and dry weight of Pennisetum purpureum

圖6 Cu2+對(duì)象草苗高和根長(zhǎng)抑制率的影響 Fig.6 Effects of Cu2+ on inhibition rates of seedling height and root length of Pennisetum purpureum

圖7 Cu2+對(duì)象草鮮質(zhì)量和干質(zhì)量抑制率的影響Fig.7 Effects of Cu2+on inhibition rates of fresh and dry weight of Pennisetum purpureum

活力指數(shù)是反映種子品質(zhì)的重要參數(shù)。象草種子活力指數(shù)隨Cu2+濃度增加顯著下降，說(shuō)明Cu2+脅迫會(huì)影響象草幼苗品質(zhì)。但總體來(lái)看，當(dāng)Cu2+濃度升高到100 mg·L-1時(shí)，象草的萌發(fā)雖然受到抑制，但仍有78%的種子萌發(fā)，說(shuō)明象草對(duì)Cu2+有一定的耐受性，可以嘗試用象草來(lái)進(jìn)行對(duì)Cu2+污染土壤的修復(fù)。

根系是植物最早感應(yīng)重金屬脅迫的部位，也是對(duì)重金屬毒害響應(yīng)最敏感的部位之一[13]。幾乎所有的重金屬元素都能通過(guò)植物根系進(jìn)入植物體內(nèi)，土壤中重金屬含量的多少能夠直接或間接地影響到根系的生長(zhǎng)[14-15]。Cu2+對(duì)象草幼苗高度和根長(zhǎng)表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，抑制率與Cu2+處理濃度呈正相關(guān)，且Cu2+對(duì)根系伸長(zhǎng)的抑制作用比對(duì)幼苗高度的抑制作用更顯著，這與植物根部最先接觸到重金屬污染區(qū)有關(guān)[16-17]。

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