能同時(shí)降解嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素的芽孢桿菌篩選

徐海軍，李 慧，張德華，夏倫斌，余道倫，高俊梅

（1.皖西學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，安徽 六安 237012；2.安徽九鼎農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司，安徽 六安 237000）

霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)。土壤、植物和青貯飼料中均可發(fā)現(xiàn)霉菌毒素。霉菌毒素既可在農(nóng)作物大田收獲時(shí)形成，在不適宜的貯存條件下，也可繼續(xù)在收獲后的農(nóng)作物上形成。較高的濕度通常有利于飼料中霉菌的生長和霉菌毒素的產(chǎn)生。飼料中檢出率比較高和對動(dòng)物影響比較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素。

黃曲霉毒素主要是黃曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代謝產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，均為二氫呋喃香豆素的衍生物。一般來說，溫度30 ℃、相對濕度80%、谷物水分在14%以上（花生的水分在9%以上）最適合黃曲霉菌繁殖和生長。在24～34 ℃，黃曲霉菌產(chǎn)毒量最高。

嘔吐毒素又稱脫氧雪腐鐮刀菌烯醇，主要是由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀桿菌產(chǎn)生的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性相似的有毒代謝產(chǎn)物（單端孢霉烯族化合物中的一種）構(gòu)成，主要污染小麥、大麥、玉米等谷類作物，也污染糧食制品。人和動(dòng)物在誤食被該毒素污染的糧谷類后可以產(chǎn)生廣泛的毒性效應(yīng)。

玉米赤霉烯酮又稱F2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，是一種雌激素真菌毒素。玉米赤霉烯酮主要污染玉米、麥類、谷物等，在世界各地各種糧谷與飼料中均有存在。玉米赤霉烯酮具有較強(qiáng)的生殖毒性和致畸作用，可引起動(dòng)物發(fā)生雌激素亢進(jìn)癥，導(dǎo)致動(dòng)物不孕或流產(chǎn)，對家禽、豬、牛和羊的影響較大，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。

霉菌毒素的生物降解是近年來國內(nèi)外霉菌毒素脫毒技術(shù)方面的一個(gè)研究熱點(diǎn)。徐劍宏等[1]用脫氧雪腐鐮刀菌烯醇多次傳代富集培養(yǎng)從小麥的土壤中分離到一株霉菌毒素降解菌，該菌對不同單端孢霉烯族毒素的降解率達(dá)到90%以上。牛天貴等[2]用香豆素為唯一碳源的培養(yǎng)基，以動(dòng)物糞便、發(fā)霉糧食、腐敗飼料、枯枝敗葉和發(fā)酵食品為實(shí)驗(yàn)材料，先進(jìn)行初篩，獲得能降解香豆素的菌株，再分別以黃曲霉毒素B1或赭曲霉毒素A為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行第2次篩選，結(jié)果獲得一株對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A均能降解的地衣芽孢桿菌。進(jìn)一步試驗(yàn)表明，此地衣芽孢桿菌對玉米面中低濃度和高濃度的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A均能有效降解，降解率分別達(dá)到82.9%、78.3%和75.0%、73.5%。陳志敏等[3]分別將黃曲霉毒素降解菌、玉米赤霉烯酮降解菌和嘔吐毒素降解菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后通過固液分離、超濾濃縮獲得3種細(xì)菌的霉菌毒素降解酶液，復(fù)合配制成霉菌毒素降解酶制劑，對飼料霉菌毒素的去除率達(dá)到80%以上。這些研究表明應(yīng)用酶解技術(shù)降解飼料中的霉菌毒素具有很好的應(yīng)用前景。

產(chǎn)酶益生素可以提高畜禽對日糧的消化利用率，減少糞便排放量，提高畜禽的生產(chǎn)性能。芽孢桿菌以芽孢形式存在時(shí)，對環(huán)境的抵抗力強(qiáng)，在適宜條件下又可復(fù)活，恢復(fù)生物學(xué)功能。因此，芽孢桿菌是生產(chǎn)益生素的良好菌種。本研究旨在篩選對黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮均有較好降解作用的芽孢桿菌，以便為開發(fā)具有霉菌毒素降解作用的新型產(chǎn)酶益生素奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 豬糞

安徽九鼎農(nóng)業(yè)科技發(fā)展股份有限公司原種場中的健康成年母豬正常糞便。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、瓊脂1.5 g、蒸餾水100 mL，pH7.2～7.4。

富集培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：(NH4)2HPO40.1 g、KH2PO40.1 g、Na2HPO40.2 g、Na2SO40.05 g、NaNO30.1 g、3種霉菌毒素(黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮)適量(第1、2和3次富集濃度分別為1、5、10 mg/L)、 蒸 餾 水100 mL，pH7.2～7.4。

霉菌毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基(牛天貴，2009)：蛋白胨0.5 g、牛肉膏0.3 g、霉菌毒素 0.5 mg、蒸餾水 100 mL、pH 7.2～7.4。

1.1.3 主要試劑

玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品購自天津一方科技有限公司。玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素和黃曲霉毒素的ELISA檢測試劑盒購自北京華安麥科生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器

手提式高壓滅菌鍋（上海銳風(fēng)儀器制造有限公司）、SW-CJ-2FD雙人單面超凈工作操作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、TGL-16臺式高速離心機(jī)（金壇市岸頭良友實(shí)驗(yàn)儀器廠）、GHX-9080B型隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海比朗儀器有限公司）、GKC214數(shù)顯控溫水浴鍋（上海蘇進(jìn)儀器設(shè)備廠）、生物顯微鏡（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）、318MC型酶標(biāo)儀（上海三科儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 霉菌毒素降解菌的富集培養(yǎng)

稱取0.5 g母豬糞便放入滅菌試管中，加入5 mL滅菌生理鹽水，用滅菌吸管充分吸吹混勻。用無菌紗布封好試管口后，放入80 ℃水浴中加熱15 min殺死非芽孢菌，取出冷卻后，用無菌生理鹽水按100倍、1 000倍、10 000倍梯度稀釋樣品。分別取各稀釋度的樣品溶液100 μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)7 d，直到菌落充分長出。

將各平板上長出的菌落用滅菌生理鹽水洗下，混合后作為原始菌液，約8 mL。將原始菌液放入80 ℃水浴中加熱15 min以充分殺死非芽孢菌，冷卻后吸取100 μL涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h。將長出的菌落用5 mL滅菌生理鹽水洗下，吸取100 μL菌液接種到5 mL第1次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周。取100 μL第1次富集培養(yǎng)菌液，傳代接種于5 mL第2次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周，再取100 μL所得培養(yǎng)物，傳代接種于5 mL第3次富集培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)1周。這樣共傳代富集3次。

1.2.2 霉菌毒素降解菌的定向篩選

1.2.2.1 能降解嘔吐毒素的芽孢桿菌定向篩選 將最終富集培養(yǎng)獲得的菌液10 000 r/min離心15 min，棄上清液，向沉淀中加入無菌生理鹽水5 mL，10 000 r/min離心15 min，棄上清液，同法清洗3次以除去富集培養(yǎng)菌液中殘留的富集培養(yǎng)基液。最后一次離心獲得的細(xì)菌沉淀，用5 mL滅菌生理鹽水懸浮。取100 μL菌液接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。用接種環(huán)蘸取菌液劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取營養(yǎng)瓊脂平板上長出的單菌落分別接種于5 mL嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。分別將各單菌落的培養(yǎng)液在10 000 r/min離心15 min，吸取各自上清2 mL，用嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒測定嘔吐毒素含量（T1），測定方法參照試劑盒說明書。以嘔吐毒素降解菌定向篩選培養(yǎng)基的嘔吐毒素含量（T0）為參照，計(jì)算各單菌落對嘔吐毒素的降解率：x(%)=（T0-T1）/T0×100%。

1.2.2.2 能降解玉米赤霉烯酮的芽孢桿菌定向篩選 將對嘔吐毒素降解率達(dá)70%以上的嘔吐毒素降解菌分別轉(zhuǎn)接到玉米赤霉烯酮定向篩選培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用玉米赤霉烯酮ELISA檢測試劑盒檢測玉米赤霉烯酮含量，并計(jì)算培養(yǎng)后玉米赤霉烯酮的降解率。

1.2.2.3 能降解黃曲霉毒素B1的芽孢桿菌定向篩選 將對玉米赤霉烯酮降解率達(dá)70%以上的玉米赤霉烯酮降解菌分別轉(zhuǎn)接到黃曲霉毒素B1定向篩選培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h。參照嘔吐毒素降解率的測定方法，用黃曲霉毒素B1 ELISA檢測試劑盒檢測培養(yǎng)前后培養(yǎng)液中黃曲霉毒素B1含量，并計(jì)算培養(yǎng)后黃曲霉毒素B1的降解率。

1.2.3 目標(biāo)細(xì)菌的形態(tài)觀察

選取對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1綜合降解率最理想的菌種作為目標(biāo)菌種。將目標(biāo)菌種劃線接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察記錄菌落形態(tài)。挑取單菌落，制成涂片，分別進(jìn)行革蘭氏染色和美蘭染色，觀察其菌落形態(tài)。

2 結(jié)果和分析

2.1 霉菌毒素降解菌的富集培養(yǎng)結(jié)果

圖1 不同深度豬糞溶液涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上的細(xì)菌生長結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)是獲得能同時(shí)降解主要霉菌毒素的芽孢桿菌。為了減少非芽孢菌的影響，本實(shí)驗(yàn)將豬糞稀釋液加熱后用于培養(yǎng)。盡管如此，豬糞溶液在不高于1:1 000稀釋時(shí)，涂布接種于營養(yǎng)瓊脂平板上后，仍可長出大量菌落（見圖1）。說明豬糞中的芽孢桿菌數(shù)量非常多，這在理論上為篩選出對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1能同時(shí)降解的芽孢桿菌提供了可能性。為了進(jìn)一步減少非芽孢菌對后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，本實(shí)驗(yàn)對豬糞初次分離菌再一次加熱后才用于富集培養(yǎng)。

表1 嘔吐毒素降解菌定向篩選結(jié)果 %

表2 玉米赤霉烯酮降解菌定向篩選結(jié)果 %

表3 黃曲霉毒素B1降解菌定向篩選結(jié)果 %

本實(shí)驗(yàn)的富集培養(yǎng)進(jìn)行了3次，每次培養(yǎng)時(shí)間為1周。采用較長的培養(yǎng)時(shí)間和反復(fù)富集培養(yǎng)有利于提高最終菌液中霉菌毒素降解菌的比例。

2.2 霉菌毒素降解菌定向篩選的結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)先用嘔吐毒素進(jìn)行定向篩選，結(jié)果獲得10株對嘔吐毒素降解率達(dá)70%以上的菌株，分別命名為ODS-1、ODS-2、ODS-3、ODS-4、ODS-5、ODS-6、ODS-7、ODS-8、ODS-9和ODS-10（見表1）。再用玉米赤霉烯酮對這10株細(xì)菌進(jìn)行定向篩選，結(jié)果ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8對玉米赤霉烯酮的降解率也達(dá)到70%以上（見表2）。最后用黃曲霉毒素B1對ODS-1、ODS-2、ODS-5和ODS-8進(jìn)行定向篩選，結(jié)果只有ODS-1對黃曲霉毒素B1的降解率達(dá)70%以上（見表3）。因此，本實(shí)驗(yàn)中篩選到的ODS-1對這3種霉菌毒素均有較好的降解率，是本研究的目標(biāo)細(xì)菌。

2.3 目標(biāo)細(xì)菌的形態(tài)觀察

ODS-1菌株在營養(yǎng)瓊脂平板上生長迅速，培養(yǎng)時(shí)間較短時(shí)即可長成灰白色、半透明、圓形、表面光滑的菌落，培養(yǎng)時(shí)間較長時(shí)菌落表面可皺縮（見圖2）。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果表明ODS-1菌株為革蘭氏陰性桿菌（見圖3）。

3 討論

圖2 ODS-1在營養(yǎng)瓊脂平板上生長時(shí)的菌落形態(tài)

圖3 ODS-1細(xì)菌形態(tài)。A:革蘭氏染色；B:美蘭染色。

霉菌毒素對畜牧業(yè)和人類健康都有極大的危害。飼料中霉菌毒素的污染是一個(gè)普遍現(xiàn)象。雖然物理吸附是當(dāng)前控制飼料霉菌毒素污染的主要途徑，但物理吸附劑常常只對某一種霉菌毒素有較強(qiáng)選擇性，對其他種類的霉菌毒素選擇性不強(qiáng)，并且物理吸附劑還易導(dǎo)致對營養(yǎng)素的吸附，從而可能影響營養(yǎng)素的吸收。霉菌毒素的生物降解技術(shù)具有安全性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)而被人們寄于厚望。以往的研究大多僅側(cè)重于篩選對某一種霉菌毒素有降解作用的細(xì)菌。由于飼料中污染的霉菌毒素種類繁多，特別是黃曲霉毒素B1、嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮是最常見的霉菌毒素。所以，篩選能對這3種霉菌毒素都具有較好降解作用的細(xì)菌非常重要，有利于降低生產(chǎn)成本。許多研究表明，一些細(xì)菌對霉菌毒素的降解具有多能性，即能同時(shí)降解不同結(jié)構(gòu)類型的霉菌毒素。例如，牛天貴等(2008)[2]就篩選獲得一株對黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素都具有較好降解作用的芽孢桿菌。徐劍宏等(2008)[3]則篩選到一株不產(chǎn)芽孢的德沃氏菌，該菌對飼料中嘔吐毒素、黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的降解率分別達(dá)到95.3%、92.4%和75.6%。本研究中篩選到的ODS-1菌株對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1的降解率也分別達(dá)到96.2%、94.6%和78.9%，這為將其開發(fā)成霉菌毒素降解菌劑奠定了基礎(chǔ)。

和非芽孢菌相比，芽孢桿菌具有優(yōu)良的抗逆性，能耐受飼料制料和貯存過程中的不利生存條件。因此，芽孢桿菌更有利于在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用。同時(shí)，芽孢桿菌也常常是優(yōu)良的益生菌，在畜禽的腸道中可以分泌消化酶，拮抗病原菌的生長。本研究從母豬糞便中篩選到一株對飼料中污染的主要霉菌毒素（嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B1）均有較好降解作用的芽孢桿菌，為開發(fā)具有霉菌毒素降解功能的新型產(chǎn)酶益生素提供了新思路。對于ODS-1菌株的確切鑒定還需進(jìn)一步研究。

[1] 陳志敏,丁宏標(biāo),喬宇,等.一種生物降解飼料中霉菌毒素的復(fù)合酶：中國，200910241454.7[P].2009-12-09.

[2] 牛天貴,梁志宏,計(jì)成，等.一株能同時(shí)降解黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A的菌株的篩選、培養(yǎng)和應(yīng)用：中國，200810224726.8[P].2008-12-10.

[3] 徐劍宏，史建榮，陸瓊嫻，等.一種能對霉菌毒素降解的菌株及其制劑的制備方法：中國，200810122672.4[P].2010-06-09.