雷帕霉素對高糖誘導腎小球系膜細胞增生、肥大及細胞外基質(zhì)合成的影響

卓 莉，李文歌，鄭 璞

（中日友好醫(yī)院 腎內(nèi)科，北京 100029）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病最嚴重的并發(fā)癥之一，是導致終末期腎病常見的原因，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。DN的發(fā)病機制十分復雜，至今尚未完全闡明，而目前也缺乏特異有效的干預方法。眾多研究表明，高糖血癥在DN的發(fā)生中，起關鍵作用；高血糖及糖基化終產(chǎn)物生成增多后將引起腎小球系膜細胞增生、肥大，細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增多，系膜擴張等形態(tài)學改變，最終導致其生理功能的喪失[1，2]。本文采用高糖誘導建立大鼠腎小球系膜細胞增生肥大模型，觀察雷帕霉素（rapamycin，RAP）對其的干預效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1640及DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）、胎牛血清、MTT（美國Sigma公司）、Micro BCA Protein試劑盒（美國Pierce公司）、小鼠ColⅣ單克隆抗體及小鼠FN單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、HRP標記的羊抗鼠，羊抗兔IgG（北京中山公司）、ECL顯色系統(tǒng)（美國Santa Cruz公司）、雷帕霉素（美國Alexis公司）、流式細胞儀（美國BD公司）、MINI-PROTEIN2電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及實驗分組

大鼠腎臟系膜細胞株RMC為我室保存，用含10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。細胞生長到50%密度時，用含1%胎牛血清的培養(yǎng)液同步24h，并調(diào)整葡萄糖濃度為以下6組：正常糖組（5.5mmol/L葡萄糖）、滲透壓對照組（5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇）、高糖組（30mmol/L葡萄糖）、高糖+RAP1組（30mmol/L葡萄糖+雷帕霉素1ng/ml）、高糖+RAP2組（30mmol/L葡萄糖+雷帕霉素2ng/ml）和高糖+RAP3組（30mmol/L葡萄糖+雷帕霉素5ng/ml），于37℃5%CO2條件下培養(yǎng)48h，進行各項指標檢測。根據(jù)我們前期的實驗研究及以往文獻提示[3]，30mmol/L葡萄糖即可誘導腎小球系膜細胞增生肥大，故此在該實驗中，我們選定此濃度造模。

1.2.2 MTT法檢測細胞相對活力和相對細胞數(shù)

系膜細胞以每孔2000個接種于96孔板，按比例分別加入甘露醇、高糖及不同濃度雷帕霉素，在到達各時間點時加入MTT（終濃度5μg/ml），37℃孵育3h，棄去上清，加入二甲基亞砜100μl，室溫溶解20min，分光光度計570nm讀取OD值。每組設6個復孔，共重復3次。

1.2.3 系膜細胞體積大小測定

表1 MTT法檢測系膜細胞吸光度（OD值）的變化

不同組細胞各3瓶，48h后離心，收集細胞，PBS洗2次，加入70%乙醇（4℃預冷）固定，4℃過夜，離心后PBS洗2次，碘化丙啶（PI）室溫避光染色30min后上流式細胞儀，以前向角散射光（forward scatter，F(xiàn)SC）平均強度表示細胞大小。

1.2.4 細胞蛋白質(zhì)提取及Western印跡法檢測FN及ColⅣ的表達

細胞加200μl預冷的RIPA裂解液（含50mM Tris pH7.5，150mM NaCl，1%Np-40，0.1%SDS，10mM EDTA，1mM PMSF及蛋白酶抑制劑2μg/ml aprotinin，2μg/ml leupeptin），4℃12000rpm 離 心25min，吸取上層液體經(jīng)Micro BCA Protein Kit測蛋白濃度。取100μg總蛋白，加2×SDS上樣緩沖液，100℃變性5min。進行10%SDS-PAGE分離（電壓分別為：積層膠60V，分離膠100V），將膠中蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉4h，加1∶200一抗4℃過夜，加1∶1000 HRP標記的二抗室溫孵育1h，TBST洗后用ECL顯色。所得結(jié)果以β-actin為參照，用UVP-2000凝膠圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學處理

應用SPSS15.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料先進行正態(tài)分布檢驗，組間差異比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析。

2 結(jié)果

2.1 不同劑量雷帕霉素對系膜細胞增生能力的影響

與正常及滲透壓對照組相比，在高糖刺激下，系膜細胞明顯增殖；雷帕霉素能顯著抑制這一作用（P＜0.05），且呈劑量依賴性（見表1）。

2.2 不同劑量雷帕霉素對系膜細胞大小的影響

FSC不依賴任何細胞樣品的制備技術（如染色），是細胞的物理參數(shù)，它與被測細胞的大小有關，確切的說與細胞直徑的平方密切相關；FSC的強度越大，表明細胞的體積越大，反之亦然。我們流式細胞儀檢測的結(jié)果顯示，與正常及滲透壓對照組相比，高糖組細胞FSC熒光強度增加，提示高糖組細胞體積增大，但無顯著性差異（P＞0.05）；與高糖組相比，RAP組細胞FSC熒光強度顯著減弱，即細胞體積明顯減小，且呈劑量依賴性，組間兩兩相比，均有顯著性差異（P＜0.05）。見圖1。

圖1不同組FSC熒光強度

2.3 不同劑量雷帕霉素對FN、ColⅣ表達的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，在高糖刺激下，F(xiàn)N及ColⅣ蛋白的表達水平皆比正常及甘露醇對照組高；雷帕霉素能下調(diào)FN及Col IV蛋白的表達，且呈劑量依賴性（見圖2及圖3），提示雷帕霉素能顯著減少高糖導致的ECM的增多。

圖3 Western blot檢測FN、Col IV蛋白的半定量結(jié)果

3 討論

DN已是終末期腎病發(fā)病的主要原因之一，30%～50%的糖尿病患者可合并DN，其主要病理特征為腎小球系膜細胞增生、肥大，系膜基質(zhì)增加，甚至形成結(jié)節(jié)，基底膜增厚及腎小球毛細血管硬化等微血管病變，最終將發(fā)展為腎小球硬化，致使腎功能喪失。ECM合成增加和（或）降解減少是其發(fā)展的重要機制[3～6]。高血糖一直被認為是與糖尿病各種并發(fā)癥關系最為密切因素之一，其可導致系膜細胞增生肥大及ECM的產(chǎn)生，加速腎臟功能的惡化。而如果有效抑制了腎小球系膜細胞的增生、肥大，則有助于預防或改善DN的病變，延緩DN的進展。本實驗中利用高糖模擬糖尿病患者體內(nèi)的高糖環(huán)境，探討雷帕霉素對于腎小球系膜細胞增生、肥大及ECM產(chǎn)生的影響。

雷帕霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，從目前動物實驗及臨床應用的效果看，它具有療效好、低毒、無腎毒性等特征，故現(xiàn)在主要應用于自身免疫性異常及器官移植排斥反應的治療。另外，雷帕霉素藥物洗脫支架在冠心病患者中也得到了廣泛的應用，大量實驗及臨床資料證實，雷帕霉素可以顯著減少血管平滑肌細胞的增殖，預防支架內(nèi)的再狹窄，降低冠心病再梗率[7～9]。它還可以減少胎牛血清刺激引起的腎成纖維細胞的增殖和DNA合成，并能抑制轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、血管內(nèi)皮生長因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）等細胞因子的表達，從而減輕小球系膜基質(zhì)的聚積[5，10，11]。Onq的研究也表明，雷帕霉素能通過調(diào)節(jié)細胞周期及ECM蛋白纖維連接蛋白（fibronection，F(xiàn)N）、膠原和α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）的表達可逆性減輕瘢痕疙瘩的形成[12]。通過動物實驗，國內(nèi)外學者也證實，雷帕霉素可顯著抑制DN及5/6腎切除后代償性的腎小球的肥大[13，14]。與前人的研究結(jié)果[15]一致，我們的實驗證實，高糖確實能誘導大鼠系膜細胞增殖；而在使用了雷帕霉素后，高糖誘導的細胞增殖明顯被抑制（P＜0.05），且呈劑量依賴性。雷帕霉素的終濃度在1ng/ml時即可起效，且隨濃度的增大，其抑制增殖作用增強。與此同時，雷帕霉素下調(diào)了FN及ColⅣ的蛋白水平，減輕ECM的產(chǎn)生。而這一作用，也是呈現(xiàn)劑量依賴性，提示雷帕霉素抑制細胞增殖及減輕ECM產(chǎn)生的作用的強弱與劑量有關。本部分實驗在細胞水平上證實了：雷帕霉素能抑制高糖狀態(tài)下系膜細胞的增生及肥大。根據(jù)雷帕霉素這一效應，今后將有望將其應用到DN防治方面，但仍需要更進一步的研究提供詳實的證據(jù)。

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