肝素連接苯丙氨酸血液凈化材料去除內(nèi)毒素的研究

靳欣欣 王 翔 毛金春 唐福州 熊延連

(重慶大學(xué)生物流變學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400044)

引言

內(nèi) 毒 素 (endotoxin， ET ) 即 脂 多 糖(lipopolysaccharides，LPS)。人體在嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染時(shí)易引發(fā)內(nèi)毒素血癥(Endotoxemia，ETM)，進(jìn)而引起全身炎癥反應(yīng)綜合征、膿毒癥、多器官功能障礙綜合征等。

利用血液凈化方法［1］去除體內(nèi)內(nèi)毒素是現(xiàn)在臨床研究重點(diǎn)，其根本是尋找一種高效安全的凈化吸附材料。

內(nèi)毒素的吸附原理是利用了內(nèi)毒素分子的負(fù)電性、疏水親水性及含有大量可形成氫鍵的-OH，吸附作用包括了靜電作用、氫鍵作用、疏水作用［2］:靜電作用去除內(nèi)毒素主要是利用了內(nèi)毒素在pH 值大于1.3 時(shí)帶負(fù)電的特性。正電性分子如-NH2可吸附內(nèi)毒素。在3 種吸附作用中，靜電吸附相對(duì)而言是吸附率最高的。但缺點(diǎn)是因血液中的蛋白多為負(fù)電性，所以共吸附現(xiàn)象嚴(yán)重，選擇性不高。

氫鍵吸附利用了材料分子上所帶的可以與內(nèi)毒素形成氫鍵作用的官能團(tuán)，如-COOH、-OH等。氫鍵吸附是三種吸附中作用力最弱的，但如果在-NH2的β 位上存在-OH，此時(shí)的氫鍵作用可大大強(qiáng)化-NH2的靜電吸附作用，這是因?yàn)棣?位形成的氫鍵在分子構(gòu)型中可與內(nèi)毒素分子形成穩(wěn)定的八元環(huán)［3］。

疏水吸附利用的是材料分子上有疏水作用的官能團(tuán)，基于了內(nèi)毒素分子具有親水、疏水的雙相性。疏水作用在三種吸附作用中的作用力居中，但其吸附選擇性要優(yōu)于靜電作用。

血液凈化吸附內(nèi)毒素材料通常都是通過(guò)大分子樹脂等直接連接配基或者引入間隔臂連接配基。配基材料的選用是決定吸附材料性質(zhì)最關(guān)鍵的因素，Mitzner 等將聚乙烯亞胺(PEI)固定于纖維素球載體，吸附內(nèi)毒素效果明顯［4］;將純化的血清白蛋白共價(jià)交聯(lián)在聚甲基丙烯酸酯上，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)可通過(guò)靜電作用吸附內(nèi)毒素、TNF、IL-6 等［5］;多粘菌素B是唯一有抗內(nèi)毒素作用的抗生素［6］，特異性強(qiáng)、吸附效率高，但其具有腎毒性和神經(jīng)毒性，使用受到限制［7-8］。

應(yīng)用氨基酸作為內(nèi)毒素吸附材料的研究，方暉［9］等人曾采用球形纖維素連接多種氨基酸，從而研究了其不同的吸附效率，徐堃［10］、韋俊華［11］則研究了以PVDF 基膜連接不同氨基酸的內(nèi)毒素吸附材料。

近年來(lái)用血液凈化法治療內(nèi)毒素血癥取得了一定的進(jìn)展，在水溶液中很多吸附材料都可以達(dá)到相當(dāng)高的吸附率(約為90%)［9-11］，但是血漿中的吸附率以及材料的血液相容性、安全無(wú)毒性等都有待提高。

綜合考慮以上因素，本課題選擇了對(duì)人體安全無(wú)害的肝素連接苯丙氨酸制成吸附材料。該材料兼具了安全無(wú)毒性和良好的血液相容性，同時(shí)依據(jù)肝素的氫鍵吸附和苯丙氨酸的疏水吸附來(lái)保持較高的血漿中的內(nèi)毒素吸附率。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路

本課題研究的內(nèi)毒素吸附材料，是采用氨基化后的氯球作為基底材料，之后連接肝素作為連接臂，再連接苯丙氨酸，利用了肝素上-NH2的β 位羥基可形成分子內(nèi)氫鍵以及苯丙氨酸的疏水性來(lái)進(jìn)行內(nèi)毒素吸附。

1.1 基底材料的選擇

選用氯甲基樹脂，俗稱氯球(ps)是吸附劑常用的載體材料，特點(diǎn)是力學(xué)性能適宜、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、易吸附疏水性物質(zhì)，其官能團(tuán)氯甲基可作為偶聯(lián)其他連接臂或者直接連接配基的活性基團(tuán)，有利于進(jìn)行樹脂表面的改性。

1.2 連接臂的選擇

肝素(heparin)是一種天然生物活性多糖類的化合物，具有抗凝血性，在體內(nèi)體外都有抗凝血作用，同時(shí)生物相容性良好，這也是本課題采用肝素作為連接臂的主要考量之一。

肝素連接有較多化學(xué)活性官能團(tuán)，利于與不同配基的連接。雖然在人體內(nèi)生理環(huán)境下帶負(fù)電荷，但具有可以形成氫鍵的官能團(tuán)-COOH、-OH，此外正電性基團(tuán)-NH2具有β 位羥基，會(huì)加強(qiáng)其靜電吸附的作用，這些特性都增強(qiáng)了吸附內(nèi)毒素的能力;而作為臨床上常用的凝血?jiǎng)?，肝素可以減少材料對(duì)血液中蛋白的吸附，同時(shí)提高了對(duì)內(nèi)毒素的特異性吸附。圖1 為肝素的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖1 肝素分子結(jié)構(gòu)圖Fig．1 The heparin molecular structure diagram

血液凈化過(guò)程中，為避免凝血，管路都需進(jìn)行肝素化涂層，而直接利用肝素作為吸附材料的組成之一，這也有利于透析過(guò)程中的抗凝血。

1.3 配基的選擇

配基的選擇，考慮到氨基酸對(duì)人體的安全性以及良好的血液相容性，以及此前有很多相關(guān)機(jī)理的研究，因此認(rèn)為肝素分子臂連接氨基酸是較為適宜和有發(fā)展前景的一種吸附材料。20 種氨基酸中，因?yàn)殪o電吸附選擇性不高且連接臂肝素為負(fù)電性會(huì)互相抵消吸附效果，所以沒有選擇正電性的堿性氨基酸;氫鍵吸附作用力弱，未選擇含有兩個(gè)-COOH的酸性氨基酸;從中性氨基酸中選擇疏水性比較強(qiáng)的芳香族氨基酸——苯丙氨酸，其特點(diǎn)是非極性氨基酸，等電點(diǎn)為5.48。其他芳香族氨基酸有:酪氨酸屬于極性氨基酸(無(wú)疏水性)且等電點(diǎn)(5.68)與苯丙氨酸接近;色氨酸雖然同樣屬于非極性氨基酸，等電點(diǎn)(5.89)也與苯丙氨酸接近，但是從立體構(gòu)象上而言，對(duì)稱性不強(qiáng)。圖2 為苯丙氨酸和色氨酸的球棍模型圖。

圖3 為肝素分子連接苯丙氨酸的預(yù)想結(jié)構(gòu)模型圖。本研究希望達(dá)到的效果是:肝素含有大量重復(fù)基團(tuán)氨基和羧基，苯丙氨酸通過(guò)羧氨縮合反應(yīng)與肝素大分子鏈相連，其苯環(huán)垂直于肝素分子鏈，構(gòu)成如右圖所示的類似樹干(圖中涂黑底色外較深色分子，即肝素分子鏈)與樹杈的結(jié)構(gòu)。同時(shí)這種樹型結(jié)構(gòu)通過(guò)肝素與載體樹脂的共價(jià)縮合而包裹在樹脂球表面，吸附過(guò)程中在血漿中擾動(dòng)進(jìn)而通過(guò)疏水和氫鍵的雙重作用吸附內(nèi)毒素分子。這也是沒有選擇其他非芳香族疏水性氨基酸的原因。

圖2 苯丙氨酸(左)、色氨酸(右)球棍模型Fig． 2 Phenylalanine (left )，Tryptophan (right)stick model diagram

圖3 肝素分子鏈連接苯丙氨酸預(yù)想模型Fig． 3 The expected model of heparin molecular chain connection phenylalanine

2 材料和方法

2.1 試劑和儀器

氯甲基樹脂(天津南開合成科技有限公司，中國(guó))、肝素鈉(重慶百萃生物科技有限公司，中國(guó))、L-苯丙氨酸(成都市科龍化工試劑廠，中國(guó))、甲苯胺藍(lán)(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))、EDC(Sigma 公司，美國(guó))、NHS(Sigma 公司，美國(guó))、內(nèi)毒素/顯色基質(zhì)鱟試劑盒(廈門鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，中國(guó))，所有試劑均為分析純。傅里葉變換紅外光譜儀(Spectrum GX，Perkin Elmer 公司，美國(guó))、紫外-可見分光光度計(jì)(TU-1901，北京普析通用儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，中國(guó))、倒置熒光顯微鏡(IX71，OLYMPUS 公司，日本)、恒流泵(HL-2，上海青浦滬西儀器廠，中國(guó))、血液細(xì)胞分析儀(BC-2000，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國(guó))、全自動(dòng)血液生化分析儀(BS-200，深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司，中國(guó))。

2.2 氨基化氯球的制備

5 g 氯球(ps)在1，4-二氧六環(huán)溶液中溶脹2 h后轉(zhuǎn)移至250 mL 三口燒瓶中;5.0 g NaOH、0.2 g 四丁基溴化銨溶于40 mL 蒸餾水加入反應(yīng)體系;向反應(yīng)體系中加入50 mL 乙二胺，反應(yīng)混合物于85 ℃攪拌反應(yīng)6 h，得到氨基化氯球(ps-NH2):

2.3 肝素化氯球的制備

用Na2HPO4和檸檬酸配制檸檬酸緩沖液，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至4.7(EDC 最佳活性條件)，加入催化劑EDC 與NHS(摩爾比值為1∶1);配制一定濃度肝素檸檬酸緩沖液，0.5 g 的ps-NH2浸入肝素溶液中，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)數(shù)小時(shí)，得到肝素化氯球(ps-hep)。

2.4 肝素-苯丙氨酸吸附材料的制備

圖4 為EDC/NHS 催化羧氨縮合反應(yīng)的機(jī)理［12］。EDC 通過(guò)與-COOH 反應(yīng)形成O-?；惲螂逯虚g體，然而，該中間體在水溶液中很不穩(wěn)定，易于水解。O-酰基異硫脲中間體在NHS 存在的情況下，可以轉(zhuǎn)變?yōu)?NH2反應(yīng)活性的NHS-活性酯，這種NHS-活性酯中間體非常穩(wěn)定，可以允許將縮合反應(yīng)分解成兩步進(jìn)行。

在肝素連接苯丙氨酸的反應(yīng)中，肝素和苯丙氨酸都存在-NH2與-COOH，-NH2是正電性基團(tuán)，利用靜電作用吸附內(nèi)毒素，而-COOH是負(fù)電性基團(tuán)，利用氫鍵吸附內(nèi)毒素，而這兩種吸附作用靜電吸附作用力更強(qiáng)，因此希望苯丙氨酸盡量使用-COOH與肝素的-NH2反應(yīng)，進(jìn)而保留自身的-NH2。

所以這一步中催化劑的使用有所不同，具體步驟為:用Na2HPO4和檸檬酸配制檸檬酸緩沖液，用NaOH 調(diào)節(jié)pH，加入催化劑EDC 活化一定質(zhì)量的苯丙氨酸0.5 h(目的是提高苯丙氨酸中-COOH的活化比例)，再加入EDC/NHS(摩爾比值為1∶1)及含有2.5 g ps-hep 的檸檬酸緩沖液，37 ℃恒溫振蕩反應(yīng)數(shù)小時(shí)，得到肝素-苯丙氨酸吸附材料(hep-Phe)。

圖4 EDC/NHS 催化酰胺反應(yīng)原理Fig． 4 The mechanism of catalyzing acid amid condensation reaction by EDC/NHS

2.5 紅外光譜法檢測(cè)氨基化氯球

將制備好的ps-NH2真空干燥24 h 后，采用紅外光譜法對(duì)其進(jìn)行分析鑒定，觀察氯球經(jīng)乙二胺活化前后所發(fā)生的變化。

2.6 甲苯胺藍(lán)法檢測(cè)肝素固定量

試管中加入10 mg 的ps-NH2，5 mL 0.2% 的NaCl 溶液，1 mL 0.005% 的甲苯胺藍(lán)溶液，混合均勻，于恒溫振蕩箱37 ℃反應(yīng)2 h。取樣品試管上層液體2 mL，加入分液漏斗中，然后各加入2 mL 正己烷，劇烈振蕩，萃取一定時(shí)間后在紫外分光光度計(jì)631 nm 處測(cè)其吸光度，并比照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算肝素固定量。通過(guò)改變肝素初始濃度和反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)來(lái)尋找最佳反應(yīng)條件。

2.7 紫外吸收法測(cè)定苯丙氨酸固定量

小心收集肝素連接苯丙氨酸反應(yīng)后的洗脫液，因?yàn)楦嗡胤肿咏Y(jié)構(gòu)中不含苯環(huán)，所以對(duì)測(cè)定影響不大。故可于254 nm［13］下測(cè)定洗脫液的紫外吸收，利用差量法計(jì)算苯丙氨酸的固定量。

2.8 熒光顯微鏡觀察材料對(duì)熒光內(nèi)毒素(FITCLPS)的吸附

將0.2 g 的ps-NH2、ps-hep 以 及hep-Phe 在 含有50 μg/mL FITC-LPS 的兔子血漿溶液中分別進(jìn)行了吸附實(shí)驗(yàn)，吸附反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)為2 h，通過(guò)倒置熒光顯微鏡觀察表面熒光強(qiáng)度來(lái)定性觀察吸附情況。

2.9 鱟試劑盒測(cè)定內(nèi)毒素的吸附

鱟試劑顯色基質(zhì)法用于內(nèi)毒素的定量檢測(cè)，基本原理為細(xì)菌內(nèi)毒素與鱟試劑中C 因子進(jìn)行酶促反應(yīng)，產(chǎn)生凝固酶，其可將人工合成的顯色基質(zhì)分解為黃色的對(duì)硝基苯胺(PNA)和多肽。PNA 可進(jìn)一步被偶氮試劑染成玫瑰色，在545 nm 下測(cè)量反應(yīng)液中的吸光度值而進(jìn)行內(nèi)毒素定量。

吸附實(shí)驗(yàn)中，將0.5 g 的吸附材料填充入2 mL的注射器中，兩頭用脫脂棉塞住，連接恒流泵和燒杯自制成血液灌流裝置進(jìn)行血漿灌流動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)。

利用鱟試劑盒檢測(cè)hep-Phe 吸附材料分別與不同內(nèi)毒素初始濃度的水溶液及兔子血漿溶液反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)2 h 后的吸附量，確定內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附的影響。之后利用鱟試劑盒檢測(cè)相同內(nèi)毒素初始濃度下經(jīng)過(guò)不同反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)后兔子血漿溶液中內(nèi)毒素的吸附量，繪制吸附曲線。

2.10 血液相容性實(shí)驗(yàn)

用一次性注射器自制血液灌流器，裝入0.5 g hep-Phe 吸附劑，灌流前使用肝素鈉生理鹽水沖管3次，控制適當(dāng)流速，進(jìn)行離體血液灌流實(shí)驗(yàn)。吸附2 h 后，分別取20 μL 與2 mL 于血液細(xì)胞分析儀和常規(guī)全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血細(xì)胞及血液生化指標(biāo)變化。

3 結(jié)果

3.1 紅外光譜法檢測(cè)氨基化氯球

圖5 為氯甲基樹脂氨基化前后的的紅外光譜。虛線表示氨基化反應(yīng)之前，實(shí)線表示氨基化反應(yīng)之后。圖中可以看到:氨基化反應(yīng)之前，苯環(huán)上C-H的伸縮振動(dòng)峰、苯環(huán)骨架振動(dòng)、苯環(huán)CH、CH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，以及氯甲基CH2Cl 的幾個(gè)特征峰，即CH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，4 位被CH2Cl 取代1，4-二取代苯=C-H 面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰(1 265 cm-1)，以及C-Cl 伸縮振動(dòng)峰。

圖5 ps 和ps-NH2 的紅外檢測(cè)圖Fig．5 The FTIR Spectra of chloromethyl ps

氨基化反應(yīng)之后，主要特征峰未出現(xiàn)明顯變化，但3 300 ～3 377 cm-1之間則出現(xiàn)了氨基-NH2的伸縮振動(dòng)峰，而1 265 cm-1處的峰則沒有了，此峰表征了氯甲基強(qiáng)化的= C-H 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰，說(shuō)明乙二胺與苯環(huán)上的氯甲基發(fā)生了反應(yīng)，將-NH2成功引入到了氯甲基樹脂上。

3.2 連接肝素的最佳反應(yīng)條件

圖6 是肝素初始反應(yīng)濃度對(duì)肝素固定量的影響。固定反應(yīng)時(shí)間為24 h，濃度大于5 mg/mL時(shí)，其固定量基本達(dá)到飽和。

圖6 肝素濃度對(duì)肝素固定量的影響Fig．6 The influence of the heparin concentration on the fixed amount of heparin

圖7 是反應(yīng)時(shí)間對(duì)肝素固定量的影響。選用5 mg/mL 的肝素與吸附劑反應(yīng)不同時(shí)間的肝素含量進(jìn)行測(cè)定。反應(yīng)時(shí)間大于24 h 后其固定量基本達(dá)到穩(wěn)定飽和。

圖7 反應(yīng)時(shí)間對(duì)肝素固定量的影響Fig．7 The influence of the lasting time on the fixed amount of heparin

3.3 肝素連接苯丙氨酸的最佳反應(yīng)條件

圖8 是苯丙氨酸初始濃度對(duì)苯丙氨酸固定量的影響。pH 值保持4.7，反應(yīng)時(shí)間控制在24 h。苯丙氨酸固定量在濃度大于5 mg/mL 時(shí)，處于較高且穩(wěn)定的水平，基本達(dá)到飽和。

圖8 苯丙氨酸初始濃度對(duì)固定量的影響Fig．8 The influence of the Phe concentration on the fixed amount of Phe

圖9 是反應(yīng)時(shí)間對(duì)苯丙氨酸固定量的影響?？刂票奖彼岢跏紳舛葹? mg/mL，反應(yīng)體系pH 值為4.7，當(dāng)時(shí)長(zhǎng)大于24 h 后固定量也基本不變，達(dá)到飽和。

圖9 反應(yīng)時(shí)間對(duì)固定量的影響Fig．9 The influence of the lasting time on the fixed amount of Phe

圖10 是體系pH 值對(duì)苯丙氨酸固定量的影響。苯丙氨酸初始濃度為5 mg/mL，反應(yīng)時(shí)間為24 h，則體系最適pH 值應(yīng)為4.7。

圖10 pH 對(duì)固定量的影響Fig． 10 The influence of the pH on the fixed amount of Phe

3.4 熒光顯微鏡觀察材料對(duì)熒光內(nèi)毒素(FITCLPS)的吸附

圖11 是兔子血漿溶液中吸附熒光標(biāo)記內(nèi)毒素的效果圖。圖中可以明顯的看到，熒光內(nèi)毒素均勻的包裹在吸附材料外層，且連接有苯丙氨酸的吸附材料效果也明顯優(yōu)于肝素化氯球和氨基化氯球的吸附。

圖11 兔子血漿溶液中吸附熒光標(biāo)記內(nèi)毒素效果ps-NH2(a)，ps-hep(b)，hep-Phe(c)Fig． 11 Adsorption FITC-LPS effect diagram in rabbit plasma solution:ps-NH2 (a )，ps-hep (b )，hep-Phe (c )

3.5 吸附性能定量實(shí)驗(yàn)-鱟試劑法檢測(cè)材料去除內(nèi)毒素效果

圖12 和圖13 是不同內(nèi)毒素初始濃度下內(nèi)毒素的吸附量和吸附率。圖12 可以看出，反應(yīng)2 h 后材料在水中和血漿中的吸附量隨著內(nèi)毒素初始濃度的增加而增加，但是圖13 表明吸附率的變化并不大;在水中的吸附率保持在79%左右而在血漿中吸附率約為68%，最高可達(dá)到72%。

圖12 內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附量的影響Fig．12 The influence of the initial concentration of the LPS adsorption amount

圖13 內(nèi)毒素初始濃度對(duì)吸附率的影響Fig．13 The influence of the initial concentration of the LPS adsorption rate

圖14 為反應(yīng)時(shí)間與內(nèi)毒素吸附量的影響。是內(nèi)毒素初始濃度為0.5 EU/mL，吸附時(shí)間2 h 之內(nèi)的血漿溶液內(nèi)毒素吸附量曲線圖:由圖14 中可以看出，吸附材料在0.5 h 處就已達(dá)到最大吸附量的90%以上的吸附率，并且在1 h 左右達(dá)到了吸附平衡。

圖14 血漿中吸附時(shí)間對(duì)內(nèi)毒素吸附量的影響Fig． 14 The influence of the lasting time on LPS adsorption amount

3.6 血液相容性實(shí)驗(yàn)

表1 為經(jīng)體外模擬灌流后血液成分的變化。灌流2 h 后，血液成分變化不大，血細(xì)胞相對(duì)變化率都在5%以下，血漿蛋白的相對(duì)變化率則在10%以下，即血漿蛋白能夠有90%以上的回收率，其中血小板前后變化率在5%以下，在臨床可接受范圍內(nèi)。

表1 灌流材料對(duì)血液成分的影響Tab．1 The material affect on the blood component

4 討論和結(jié)論

材料的合成分為三部分:

第一步將基底材料氯球氨基化，合成氨基化氯球ps-NH2，合成結(jié)果利用紅外檢測(cè);

第二步利用EDC/NHS 作為催化劑進(jìn)行羧氨縮合反應(yīng)，將肝素連接到ps-NH2上合成肝素化氯球ps-hep，經(jīng)甲苯胺藍(lán)法檢測(cè)結(jié)果為:選用5 mg/mL 作為肝素反應(yīng)初始濃度，并且最適反應(yīng)時(shí)間控制在24 h，可以達(dá)到肝素分子在材料表面的最佳固定量，從而使肝素分子盡可能發(fā)揮其結(jié)構(gòu)的空間效應(yīng)及生物活性，從而改善材料的生物相容性，為進(jìn)一步固定氨基酸減少更多的空間位阻;

第三步仍然利用EDC/NHS 作為催化劑進(jìn)行羧氨縮合反應(yīng)，考慮到其催化機(jī)理，先用EDC 活化反應(yīng)過(guò)程中提供-COOH 的苯丙氨酸，之后再加入EDC/NHS 與ps-hep，得到肝素連接苯丙氨酸吸附材料hep-Phe。利用紫外吸收法檢測(cè)結(jié)果為:苯丙氨酸連接內(nèi)毒素的實(shí)驗(yàn)條件選擇為苯丙氨酸初始濃度5 mg/mL，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)24 h，體系pH 值4.7 可以達(dá)到最大固定量。推測(cè)此pH 值是由于——反應(yīng)催化劑EDC 的最適反應(yīng)條件為4.7 ～6.0，而苯丙氨酸等電點(diǎn)為5.48，在低于等電點(diǎn)的pH 溶液中，苯丙氨酸發(fā)生堿式解離，其自身-COOH 更易發(fā)生羧氨縮合形成酰胺。

通過(guò)hep-Phe 對(duì)FITC-LPS 的吸附結(jié)果可以定性的得出結(jié)論:熒光內(nèi)毒素均勻的包裹在吸附材料外層，且連接有苯丙氨酸的吸附材料效果也明顯優(yōu)于肝素化氯球和氨基化氯球的吸附，說(shuō)明苯丙氨酸作為配基的引入可以大大提高肝素對(duì)內(nèi)毒素的吸附效果。

通過(guò)自制灌流器對(duì)兔子血漿的吸附，材料在水中和血漿中的吸附量隨著內(nèi)毒素初始濃度的增加而增加，但是吸附率變化并不大;在水中的吸附率保持在79%左右，而在血漿中吸附率約為68%，最高可達(dá)到72%。這是因?yàn)檠獫{中存在的血漿蛋白與內(nèi)毒素在材料表面存在的吸附競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。對(duì)于內(nèi)毒素的吸附效應(yīng)，因?yàn)檠獫{蛋白與內(nèi)毒素都帶有大量負(fù)電荷，故疏水吸附比靜電吸附對(duì)于內(nèi)毒素的選擇性要更強(qiáng)一些。相比其他研究中的一些吸附材料［9-11］，雖然在水中的吸附率沒有達(dá)到90%的較高水準(zhǔn)，但在血漿中吸附率達(dá)到了72%，相比水中吸附率78% 下降較少，對(duì)內(nèi)毒素的吸附選擇性更優(yōu)異。

臨床上要求血漿與吸附材料的接觸時(shí)間介于2～6 h 之內(nèi)，因而血液凈化材料能否在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到吸附平衡至關(guān)重要，而通過(guò)不同吸附時(shí)間下測(cè)得的吸附量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出吸附材料在0.5 h 處就已達(dá)到最大吸附量的90%以上的吸附率，并且在1 h 左右達(dá)到了吸附平衡，具有一定的臨床使用價(jià)值。

理想的血液灌流吸附劑除了要有較高的吸附量外，還需要具有吸附特異性及良好的生物相容性，要達(dá)到特異選擇吸附致病物質(zhì)，同時(shí)對(duì)其他血液成分的非特異吸附較少的效果。

本課題所選用的基底材料氯甲基樹脂是常用的載體材料，血液相容性比較理想，而連接臂肝素為臨床用血液抗凝劑，所用配基氨基酸是存在于人體的組成蛋白質(zhì)的基本分子。理論上而言相容性良好，為了驗(yàn)證該結(jié)論，進(jìn)行了血液相容性試驗(yàn)，得出結(jié)論材料對(duì)血液成分的影響較小，在可接受范圍之內(nèi)，在目前研究中的各種內(nèi)毒素吸附材料中結(jié)果比較理想。

本課題選用氯甲基樹脂作為基底材料，肝素作為分子壁，苯丙氨酸作為配基，對(duì)水和兔子血漿分別進(jìn)行了體外模擬血液灌流實(shí)驗(yàn)吸附內(nèi)毒素，在水中的吸附率保持在79%左右，在血漿中吸附率約為68%，最高可達(dá)到72%。同時(shí)對(duì)材料的血液相容性進(jìn)行了測(cè)定，血液成分變化不大，血細(xì)胞相對(duì)變化率都在5%以下，血漿蛋白的相對(duì)變化率則在10%以下，即血漿蛋白能夠有90% 以上的回收率，其中血小板前后變化率在5% 以下，在臨床可接受范圍內(nèi)。

材料的吸附效率和血液相容性都較好，有一定的臨床應(yīng)用前景。

［1］ Panaqiotou A，Gaiao S，Ctuz DN. Extracorporeal therapies in sepsis［J］. J Intensive Care Med，2011，10(25):172 -174.

［2］ 俞玫，王慧彥，劉濤. 血液灌流用內(nèi)毒素吸附材料研究［J］.高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(8):1465 -1467.

［3］ 李紀(jì)紅，俞玫，王慧彥. 計(jì)算機(jī)模擬內(nèi)毒素吸附劑吸附機(jī)理的研究［J］. 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2006，27(6):1066 -1069.

［4］ Mitzner S， Schneidewind J， Falhenhagen D， et al．Extracorporeal endotoxin removal by immobilized polyethyleneimine［J］. Artif Organs，1993，17:775 -781.

［5］ 劉莎，劉文虎. 血液灌流技術(shù)應(yīng)用與進(jìn)展［J］. 中國(guó)血液凈化，2008，11(7):618 -621.

［6］ Dinna NC，Mark AP，Rinaldo B， et al． Effectiveness of polymyxin B immobilized fiber column in sepsis:A systematic review［J］. Critical Care，2007，11(2):1 -12.

［7］ 田爽，李濤. 用血液灌流治療內(nèi)毒素血癥的研究進(jìn)展［J］. 國(guó)際生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)雜志，2009，32(1):50 -54.

［8］ Suzuki H，Shoji H. Application of polymyxin B convalently immobilized fiber in patients with septic shock［J］. Acute Blood Purification，2010，166(10):150 -157.

［9］ 方暉，魏佼，俞耀庭. 親和吸附劑對(duì)細(xì)菌內(nèi)毒素吸附性能的研究［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2004，25(6):1056 -1059.

［10］ 徐堃. 聚偏氟乙烯接枝氨基酸親和膜及其內(nèi)毒素脫除研究［D］. 杭州:浙江大學(xué)，2010.

［11］ 韋俊華. 內(nèi)毒素特異性吸附膜的開發(fā)及實(shí)驗(yàn)性能研究［D］.杭州:浙江大學(xué)，2008.

［12］ Marijn ED. Thermo scientific product manual:NHS and sulfo-NHS ［OL］. http://www. qcbio. com/pierce/24510. htm.，2009-09-24/2013-03-28

［13］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典［M］. 2010 年版，2部，北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄99 -102.