毛霉F-32產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其對麥芽溶解性的影響

趙志超，贠建民*，艾對元，張紊瑋，李懷生

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

毛霉F-32產(chǎn)β-葡聚糖酶發(fā)酵條件優(yōu)化及其對麥芽溶解性的影響

趙志超，贠建民*，艾對元，張紊瑋，李懷生

(甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070)

為提高微生物制麥過程中毛霉菌株F-32產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活力以及改善麥芽溶解性，在單因素試驗基礎上，采用響應面試驗設計法優(yōu)化產(chǎn)酶條件，利用Design Expert 7.0軟件對產(chǎn)酶結(jié)果進行二次回歸分析，獲得最佳的發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間81h、接種量7.2%、初始pH6.0；對該條件下的菌株產(chǎn)酶情況進行驗證，產(chǎn)酶力達到15.8775U/mL。并通過微生物制麥實驗，該毛霉菌株F-32可以有效地提高甘啤4號大麥品種的制麥溶解性。

β-葡聚糖酶；產(chǎn)酶條件；響應面；優(yōu)化；麥芽溶解性

β-葡聚糖酶是一類能降解谷物中β-葡聚糖的水解酶類的總稱。該酶類包括內(nèi)-β-1,3葡聚糖酶、外-β-1,3葡聚糖酶、外-β-1,4葡聚糖酶、內(nèi)-β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶[1]。它們能夠準確地作用于β-葡聚糖分子中的糖苷鍵，將大分子的β-葡聚糖降解成小分子量片段，失去親水性和黏性，提高了富含β-葡聚糖的谷物類加工過程中的溶解速率[2]，因而在農(nóng)產(chǎn)品加工和食品生產(chǎn)領域應用非常廣泛。

麥芽是啤酒釀造的重要原料，在啤酒麥芽制造過程中，盡管大麥中β-葡聚糖的含量相對于多聚糖較低，但仍給麥汁生產(chǎn)和啤酒釀造造成不利影響[3]。而β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶和β-1,3-葡聚糖酶在此過程中對麥芽的溶解性起到至關(guān)重要的作用[4]，它們能夠?qū)Ｒ唤到獯篼湨?葡聚糖中含量較多的β-1,3-糖苷鍵[5]，同時β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶還能降解β-葡聚糖混合糖苷鍵中與β-1,3-糖苷鍵接近的β-1,4-糖苷鍵，將大麥中的β-葡聚糖水解為纖維二糖和纖維三糖[6]，解決了β-葡聚糖含量過高而引起麥汁黏度高，過濾速率慢，麥汁產(chǎn)量低，非生物穩(wěn)定性差等問題，有利于啤酒質(zhì)量和穩(wěn)定性的提高[7]。

為提高低發(fā)芽率大麥所制麥芽的溶解性，近年來出現(xiàn)了微生物制麥技術(shù)，即在制麥過程中添加啟動子微生物菌株，利用微生物產(chǎn)生的外源性酶來協(xié)助大麥胚乳細胞壁的降解，進而改善麥芽品質(zhì)[8]。目前，研究報道的制麥啟動子微生物主要有可降解β-葡聚糖、木聚糖等大分子的菌種[9]。產(chǎn)β-葡聚糖酶的微生物，主要包括細菌和真菌，已報道的有：枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)[10-11]、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)[12]、盾殼霉2134(Coniothyrium minitans)[13]、康氏木霉(Trichoderma koningii)[14]、黑曲霉(Aspergillus niger)[15]、局限曲霉(Aspergillus restrictus)[16]。2007年，Teng Da等[17]將地衣芽孢桿菌中的分泌β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)接到畢赤酵母細胞中并得到成功表達，基因優(yōu)化后的表達水平在原來的基礎上提高了10倍，其β-(1,3-1,4)-葡聚糖酶活達到333.7U/mL。目前關(guān)于毛霉屬(Mucor)產(chǎn)β-葡聚糖酶的菌株報道非常少。在長期的制麥生產(chǎn)研究中，本實驗室已成功地從原料大麥中分離得到了一株產(chǎn)β-葡聚糖酶活較高的毛霉屬菌株F-32，由于該菌株具有產(chǎn)孢子量少，生長適應性強的特點，非常適合于制麥工藝對啟動子菌株的要求。為此，本實驗以該菌株為研究對象，以其產(chǎn)酶能力作為評價指標，利用響應面法對其產(chǎn)酶條件開展進一步的優(yōu)化，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關(guān)系，旨在為將該菌株成功應用于制麥工業(yè)生產(chǎn)提供科學依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥粉，甘肅武威長城麥芽廠提供甘啤4號大麥，粉碎過篩。

標準大麥β-葡聚糖(純度≥95%) 美國Sigma公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

毛霉F-32菌株(Mucor sp.)，甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院微生物研究室分離保藏，分離自大麥表面。

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[18]；液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基：大麥粉3.0g、FeSO4g7H2O 0.001g、Na2HPO40.1g、CaCO30.5g、(NH4)2SO40.5g、MgSO4g7H2O 0.02g、NaNO30.4g、水100mL。以上培養(yǎng)基皆在121℃濕熱滅菌20min后，方可使用。

1.3 發(fā)酵種子制備

用無菌水將孢子沖洗到液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，調(diào)整孢子濃度為107，30℃恒溫振蕩培養(yǎng)48h。

1.4 葡萄糖標準曲線繪制

分別吸取1.0g/100mL的標準葡萄糖溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL置于100mL的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配制成0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mL/mg的標準液。取不同質(zhì)量濃度葡萄糖標準溶液和蒸餾水各1mL于試管中，加1mL蒸餾水，3mL DNS試劑，混勻后，放入沸水中準確反應5.0min，取出后立即置于冰水浴中降溫至室溫，以空白管調(diào)零，在540nm波長處比色，以所得的吸光度為縱坐標，對應的標準葡萄糖溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線：y=1.31x—0.0048(R2= 0.9982)?？瞻讓φ眨?.0mL的蒸餾水代替1.0mL的葡萄糖標準溶液，其他步驟同上。

1.5 β-葡聚糖酶活力測定

利用pH5.5的醋酸緩沖溶液將待測酶液稀釋適當倍數(shù)，取經(jīng)40℃預熱的酶稀釋液1.0mL和經(jīng)40℃預熱的質(zhì)量濃度為1.0g/100mL的β-葡聚糖溶液1.0mL，混勻，于40℃恒溫水浴準確反應10.0min，后加入蒸餾水1.0mL和DNS試劑3.0mL，搖勻，置于沸水中準確反應5min，取出并立即置于冰水浴中降至室溫，以空白管調(diào)零，在540nm波長處比色，記錄其吸光度。空白制作：吸取已稀釋酶液1.0mL先加入DNS試劑3mL，再加入蒸餾水1.0mL和1.0g/100mL β-葡聚糖溶液1.0mL，其他步驟同上。

酶活力定義：在40℃、pH5.5條件下，每分鐘分解大麥β-葡聚糖產(chǎn)生1μmol還原糖為1個酶活力單位，以U/mL表示。

酶活力/(U/mL)=(Ah0.7633+0.0037)hDfh1000/180t

式中：A為吸光度；Df為待測酶液的稀釋倍數(shù)；t為反應時間/min；180為葡萄糖的摩爾分子質(zhì)量/(g/mol)；1000為單位換算倍數(shù)。

1.6 單因素試驗設計

在初始產(chǎn)酶培養(yǎng)基的基礎上，對發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、初始pH值4個因素進行單因素試驗，以確定各因素影響產(chǎn)酶能力的水平區(qū)間。

1.7 響應面法試驗設計與處理

根據(jù)單因素試驗確定的影響產(chǎn)酶能力的水平區(qū)間，進行響應面設計；以產(chǎn)酶量為響應值，利用Design Expert 7.0對試驗結(jié)果進行回歸分析，建立回歸方程，獲得該菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶的最佳條件。

1.8 麥芽溶解性實驗及其溶解性指標的測定

1.8.1 制麥工藝

浸麥(29h)：浸6h斷9h→浸4h斷6h→浸4h，18℃；發(fā)芽(96h)：16℃，相對濕度95%；焙燥(22h)：45℃、5h→50℃、6h→60℃、6h→70℃、2h→83℃、3h。

1.8.2 溶解性指標測定

β-葡聚糖、浸出率、過濾速率和黏度指標參考QB/T 1686ü2008《啤酒麥芽》。

β-葡聚糖酶酶活力的測定：稱取2g樣品，加入pH6.0的醋酸緩沖液充分研磨，離心10min，其他步驟同1.5節(jié)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵溫度對產(chǎn)β-葡聚糖酶活力的影響

圖 1 不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活力的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on β-glucanase activity

溫度的變化直接影響到微生物生長代謝過程。為探尋供試菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶適宜溫度范圍，在250mL三角瓶裝液量80mL、接種種子懸液5.0%、初始pH6.5、200r/min振蕩培養(yǎng)96h的條件下，將溫度分別控制在18、21、24、27、30、33、36℃，考察其對產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見圖1。發(fā)酵溫度在30℃之前，該菌株的產(chǎn)酶能力隨著溫度的升高而增強，30℃時達到最大值，酶活力為15.2069U/mL；溫度高于30℃時，產(chǎn)酶能力有所下降。這是由于高溫對毛霉菌絲體生長的產(chǎn)生了抑制作用[19]，導致產(chǎn)酶量降低，使得β-葡聚糖酶活力迅速下降。故初步選擇30℃為最適發(fā)酵溫度。

2.2 不同發(fā)酵時間對產(chǎn)β-葡聚糖酶活力的影響

發(fā)酵時間對產(chǎn)酶能力的影響主要是通過影響微生物的生長曲線而產(chǎn)生作用。在250mL三角瓶裝液量80mL、接種種子懸液5.0%、初始pH6.5、恒溫30℃、200r/min振蕩培養(yǎng)的條件下，分別設置培養(yǎng)時間40、48、56、64、72、80、88、96h，考察其對產(chǎn)酶能力的影響，結(jié)果見圖2。

圖 2 不同發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活力的影響Fig.2 Effect of fermentation time on β-glucanase activity

由圖2可知，發(fā)酵時間從40h延長到72h時，該菌株的產(chǎn)酶能力隨著發(fā)酵時間的延長而增強，80h后增長趨于平緩，這是由于菌體生物量不斷增大，菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的競爭，出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏，導致菌體本身的生長停滯，胞外酶在缺少底物誘導的情況下也停止分泌，故初步選擇80h為最適發(fā)酵時間。

2.3 不同初始pH值對產(chǎn)β-葡聚糖酶活力的影響

圖 3 不同初始pH值對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活力的影響Fig.3 Effect of initial pH on β-glucanase activity

微生物的生長代謝和產(chǎn)酶活力都有一定的pH值適應范圍，合適的pH值對菌株的生長代謝具有促進作用，可提高菌株的產(chǎn)酶活力。在發(fā)酵溫度30℃、200r/min發(fā)酵80h、接種量5.0%、250mL三角瓶裝液量80mL的條件下，利用0.12mol/L鹽酸溶液或0.1mol/L氫氧化鈉溶液將液體培養(yǎng)基pH值調(diào)整至4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，經(jīng)pH計監(jiān)測30s內(nèi)保持穩(wěn)定，觀察其對該菌株發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶能力的影響，結(jié)果見圖3。該菌株產(chǎn)酶能力受到pH值的影響較為顯著，在pH6時菌株的產(chǎn)酶能力出現(xiàn)高峰，酶活力達到15.4043U/mL；低于或超過pH6時都會出現(xiàn)明顯的下降趨勢，說明該菌株生長的最適pH值或者所產(chǎn)酶的最適pH值為6，屬弱酸性，故初步確定pH6為最適初始pH值。

2.4 不同接種量對產(chǎn)β-葡聚糖酶活力的影響

采用合適的接種量能夠有效地縮短發(fā)酵時間，使產(chǎn)酶高峰提前[20]。在初始pH6.5、發(fā)酵溫度30℃、200r/min培養(yǎng)72h、250mL三角瓶裝液量80mL的條件下，考察接種量對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶能力的影響，結(jié)果見圖4。

圖 4 不同接種量對發(fā)酵產(chǎn)β-葡聚糖酶酶活力的影響-glucanase activityFig.4 Effect of inoculum amount onβ

由圖4可知，當接種量為1.0%時，菌體的滯留適應期延長，菌株產(chǎn)酶能力在短時間內(nèi)不能快速表達，而接種量達到2.5%以上時，產(chǎn)酶能力呈直線趨勢迅速增長，超過7.5%時，其增長趨勢逐步放緩，考慮到生產(chǎn)過程種子培養(yǎng)成本，選擇7.5%為最適接種量。

2.5 響應面設計方案與分析結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取發(fā)酵溫度(A)、發(fā)酵時間(B)、接種量(C)、初始pH值(D)4個因素每個自變量的低、中、高水平分別編碼為—1、0、+1，共29個試驗，其中24個為析因試驗，5個為中心試驗，以估計誤差。以產(chǎn)酶活力作為響應值(Y)，采用Design Expert 7.0對試驗結(jié)果進行回歸分析。因素及水平設計方案與結(jié)果見表1。

利用Design Expert 7.0軟件對表1數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到全模型回歸方程：

Y=—1110.26+24.40786A+9.48073B+13.14704C+ 111.9576D—0.02148AB+0.0488AC—0.39317AD—0.02994BC—0.14825BD—0.8804CD—0.3464A2—0.0479B2—0.4859C2—6.92657D2

對回歸方程進行的方差分析結(jié)果見表2。

表 1 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果Table 1 Box-Behnken experimental design and results for response surface analysis

表 2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variances for the fi tted regression model

表2分析結(jié)果表明，在供試溫度27～33℃范圍內(nèi)，因素A對該菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶能力的影響不顯著(P＞0.05)；因素B對該菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶能力的影響顯著(P＜0.05)，由于隨著發(fā)酵時間的延長，菌體生長經(jīng)由指數(shù)期到達穩(wěn)定期，生物量積累增多，因而產(chǎn)酶量也會隨之增加。因素C和因素D對其影響極顯著，說明在其他條件不變的情況下，應嚴格控制接種量和初始pH值，以保證最大限度地產(chǎn)酶。交互項CD顯著，其他不顯著；二次項對其影響均極顯著。該回歸模型P值小于0.0001，表明二次方程模型達到極顯著水平，模型失擬項P值為0.0861(＞0.05)，模型失擬項不顯著，即該模型在整個研究回歸區(qū)域擬合的較好。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析表明，其復相關(guān)系數(shù)R2=0.9716，表示這4個因素及其二次項能解釋Y值變化的97.16%。說明模型相關(guān)性較好；校正決定系數(shù)R2Adj=0.9432，說明94.32%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用此回歸模型解釋；該試驗的精密度達到17.718，大于純誤差值4.0，結(jié)果合理。綜上所述，可以使用該模型來分析響應面值的變化。

利用Design Expert7.0軟件，根據(jù)回歸方程繪制相應的響應曲面圖進行可視化分析，由圖5可知，各交互因素存在一個最佳的水平組合使產(chǎn)酶活力達到最高。圖5a、b、c顯示，發(fā)酵溫度與其他3個因素組合時，均在28.5～31.5℃范圍內(nèi)產(chǎn)β-葡聚糖酶活力達到最大值，說明該溫度范圍適宜菌株F-32生長，較快積累生物量，使β-葡聚糖酶活力提高；如圖5c、d、e所示，菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶活性最高時，初始pH值都處于5.75～6.25之間，說明偏酸性環(huán)境符合該菌株的生長和產(chǎn)酶條件。由響應面圖可知，因菌體生物量的積累而引起產(chǎn)酶變化的發(fā)酵時間和接種量也分別在76～84h和6.25%～8.75%范圍內(nèi)使產(chǎn)酶活力達到最高值。

圖 5 各因素交互作用對發(fā)酵產(chǎn)酶能力影響的響應面圖Fig.5 Response surface plots for the effects of fermentation conditions on β-glucanase activity

由全模型回歸方程可以看出，響應面存在最大值。經(jīng)軟件分析得出β-葡聚糖酶預測產(chǎn)量最大時的各因素取值分別是：發(fā)酵溫度29.87℃、發(fā)酵時間80.88h、接種量7.18%、初始pH5.91，預測值為15.8596U/mL。

為了驗證回歸模型預測值的準確性，以響應面分析得到的最佳產(chǎn)酶條件進行產(chǎn)酶發(fā)酵實驗，同時考慮到實際操作的可行性，將最佳條件修改為：發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間81h、接種量7.2%、初始pH6.0。經(jīng)過3次重復實驗得到β-葡聚糖酶活力的平均值為15.8775U/mL。由此可見，該回歸模型能用于β-葡聚糖酶發(fā)酵條件的預測。

2.6 供試菌株對麥芽溶解性的影響

以供試毛霉F-32菌株的上述試驗篩選的最佳產(chǎn)β-葡聚糖酶條件為參考依據(jù)，利用3種不同海拔產(chǎn)地甘啤4號大麥進行微生物制麥實驗，考察菌株對麥芽溶解性的影響，結(jié)果見表3。

表 3 不同產(chǎn)地大麥微生物制麥指標Table 3 Effect of Mucor F-32 on malt quality of barleys from different growing areas

由表3可知，添加了啟動子培養(yǎng)菌株毛霉F-32的麥芽與空白實驗相比較，β-葡聚糖酶活力、浸出率和過濾速率3個指標均有所提高，β-葡聚糖含量和麥汁黏度也有明顯降低?？梢姡谌芙庑暂^差大麥制麥過程中，該產(chǎn)β-葡聚糖酶毛霉菌株能夠利用自身的產(chǎn)酶特性協(xié)助麥芽胚乳細胞壁進一步降解，有效改善麥芽溶解性，顯著提高麥芽利用率，可作為制麥啟動子菌株使用。

3 結(jié) 論

3.1 通過單因素試驗設計，確定了影響產(chǎn)酶能力的4個因素：發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量和初始pH值的水平區(qū)間，分別為發(fā)酵溫度27～33℃、發(fā)酵時間72～88h、接種量5.0%～10.0%、初始pH5.5～6.5。

3.2 利用Design Expert 7.0對響應面試驗設計結(jié)果進行分析，并建立產(chǎn)酶活力回歸模型，確定了各因素的最佳取值水平，即最佳產(chǎn)酶活力的條件分別為：發(fā)酵溫度30℃、發(fā)酵時間81h、接種量7.2%、初始pH6.0；該條件下菌株產(chǎn)β-葡聚糖酶活力為15.8775U/mL，其可靠性在響應值的95%預測區(qū)間內(nèi)。由此可以說明，運用該回歸模型對該菌株進行產(chǎn)β-葡聚糖酶活力條件的預測是合理的。

3.3 將供試菌株作為微生物制麥的啟動子添加到制麥過程中，觀察其對麥芽溶解特性的影響，結(jié)果表明微生物麥芽的溶解性指標均有所改善，麥芽溶解特性有顯著提高。

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Optimization of Fermentation Conditions for β-Glucanase Production by Mucor F-32 and Its Effect on Malt Solubility

ZHAO Zhi-chao，YUN Jian-min*，AI Dui-yuan，ZHANG Wen-wei，LI Huai-sheng
(College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

Response surface methodology was used to optimize fermentation conditions for β-glucanase production by Mucor F-32. Quadratic regression analysis of the experimental data obtained was carried out using the software Design Expert 7.0. We established the optimum fermentation conditions as follows: fermentation temperature 30 ℃, fermentation time 81 h, inoculum size 7.2%, and initial pH 6.0. Under these conditions, the β-glucanase activity of fermentation broth was 15.8175 U/mL in validation experiments. The application of Mucor F-32 for malting Ganpi No.4 barley indicated a considerable improvement in malt solubility.

β-glucanase；production conditions；response surface methodology；optimization；malt solubility

TS261.2

A

1002-6630(2013)01-0199-06

2011-10-11

甘肅省科技重大專項計劃項目(1002NKDH029)；甘肅省自然科學研究基金計劃項目(1107RJZA128)

趙志超(1985ü)，男，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：441993726@qq.com

*通信作者：贠建民(1968ü)，男，教授，博士，研究方向為生物工程。E-mail：yunjianmin@gsau.edu.cn