藏藥莪達夏對大鼠心肌缺血再灌注NO和NOS的影響

張得鈞，杜恒，劉明成，李福安，蘆殿香，馬建濱

(1.青海大學醫(yī)學院，西寧 810001；2.青海大學生態(tài)環(huán)境工程

學院，西寧 810016；3.青海師范大學生命與地理學院，西寧 810008)

藏藥莪達夏對大鼠心肌缺血再灌注NO和NOS的影響

張得鈞1,2，杜恒1，劉明成2，李福安1，蘆殿香1，馬建濱3

(1.青海大學醫(yī)學院，西寧 810001；2.青海大學生態(tài)環(huán)境工程

學院，西寧 810016；3.青海師范大學生命與地理學院，西寧 810008)

目的 研究藏藥莪達夏水提物對大鼠心肌缺血再灌注后，心肌組織中NO含量、一氧化氮合酶(NOS)、誘導性一氧化氮合酶(iNOS)活性的影響，從而探討其對心肌缺血再灌注損傷保護作用的分子機制。方法 采用結扎大鼠冠脈左前降支的方法造成心肌缺血再灌注模型，測定再灌注40 min后心肌組織中NO含量以及NOS、iNOS的活性。結果 心肌缺血再灌注模型組心肌組織中NOS、iNOS活性和NO含量水平明顯高于正常對照組。莪達夏水提物高、中、低劑量組心肌組織中NOS、iNOS活性水平以及NO含量水平均低于模型組。結論 藏藥莪達夏能夠通過降低NOS、iNOS活性和NO含量水平，從而對大鼠缺血再灌注心肌損傷產生保護作用。

莪達夏；心肌缺血再灌注；一氧化氮；一氧化氮合酶

莪達夏(Oxytropis falcate Bunge)為豆科棘豆屬鐮形棘豆植物，據《晶珠本草》記載，莪達夏具有生肌愈瘡、利便、防止骨刺產生、治病痛、清熱除毒、澀脈止血之功效，并能清毒、治療炭疽病、麻風病及流感、扁桃體炎，被譽為“草藥之王”[1]。有關莪達夏的研究被許多學者所關注[2-4]，現代藥理學研究證明，其對心血管系統(tǒng)具有良好的保護作用，其所含總黃酮苷元能增加離體心臟冠脈的灌流量，對心縮力產生抑制作用。其所含的喹喏里西定類生物堿，具有抗心律失調的生理活性[5]。一氧化氮(NO)是重要的生物作用調節(jié)分子，作用非常廣泛，其合成受一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)表達及其活性的調節(jié)。一些研究發(fā)現，NO釋放減少與許多心血管病的發(fā)生發(fā)展有關[6-8]，如心絞痛、心肌梗死、高血壓等。本實驗通過復制大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察大鼠心肌組織中NO的含量以及NOS、誘導性一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)活性的變化，探討藏藥莪達夏抗心肌缺血再灌注損傷保護作用的機制。

1 材料

1.1 動物

2月齡SD大鼠60只，♀♂各半，體質量(150± 20)g，購自甘肅中醫(yī)學院實驗動物中心，動物許可證編號：SCXK(甘)2012-0004。

1.2 儀器

DW.2000型小動物人工呼吸機(上海嘉鵬科技有限公司)；RM-6280型多道生理信號采集處理系統(tǒng)(上海軟隆科技發(fā)展有限公司)；Beckmancoulter UniCel DxC 800 Synchron全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特有限公司)；JY5002 型電子天平(上海升隆電子科技有限公司)；JEOL-1230透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)。

1.3 藥物及試劑

莪達夏原藥材采自青海省青海湖畔沙丘地帶，經青海大學醫(yī)學院魏全嘉教授鑒定為藏藥莪達夏。莪達夏全草水提取部分制備：將采得的藥材分揀干凈、粉碎，并按1∶10的比例加純化水，靜置12 h后，于電磁爐中90 ℃煎煮直至成膏狀，置60 ℃恒溫箱中烘干，得成藥，用打粉機粉碎至顆粒狀，獲得藥粉水提物粗品備用。普萘洛爾(山西晉太藥業(yè)，規(guī)格：10 mg·片-1，批號：20110502)；NO測試試劑盒(批號：2012022008)、NOS測試試劑盒(批號：20120220012)、NOS分型測試試劑盒(批號：20120220013)均購自北京瑞格博科技發(fā)展有限公司；氨基甲酸乙酯(烏拉坦，上海吉化有限公司，批號：110919)。

2 方法與結果

2.1 動物分組與給藥

將大鼠按每組10只，♀♂各半，隨機分為6組：①假手術組；②模型組；③莪達夏水提物高劑量組；④莪達夏水提物中劑量組；⑤莪達夏水提物低劑量組；⑥對照組。莪達夏給藥劑量按照文獻[9]和預實驗中莪達夏急性毒理學最大致死量的結果設定，高劑量組按照最大致死量的十分之一確定，給藥高、中、低劑量分別為15，10，5 g·kg-1·d-1。假手術組和模型組給等量純凈水，對照組以普萘洛爾0.6 g·kg-1·d-1給藥，各組連續(xù)灌胃給藥10 d。

2.2 動物模型建立

將大鼠末次灌胃給藥禁食24 h后，25%烏拉坦腹腔注射麻醉(5 mL·kg-1)。仰臥固定于手術臺上，將針狀電極插入四肢皮下，連接RM-6280型多道生理信號采集處理系統(tǒng)，穩(wěn)定5 min后記錄正常Ⅱ導聯心電圖；切開氣管，連接動物呼吸機，沿胸骨左緣剪開3、4、5肋骨，暴露心臟，剪開心包膜。以左冠狀動脈為標志，用3/8圓3X10不銹鋼圓針，在左冠狀動脈下穿一3-0絲線。進針深度為穿過心肌1 mm左右，進出針間寬度在動脈周圍1.5～2 mm左右，穩(wěn)定15 min左右，待各指標穩(wěn)定，將一細小乳膠管墊于血管與結扎線之間，拉緊結扎線使細小乳膠管壓迫左冠狀動脈而致閉塞。結扎30 min后，松開結扎線再灌注40 min，依心電圖上ST段抬高≥0.3 mV和(或)T波高聳及局部心肌出現發(fā)紺作為心肌缺血標志，心電圖ST段降低和(或)T波恢復及心肌缺血區(qū)轉紅為再灌注成功標志[10]。

2.3 統(tǒng)計學處理

2.4 心電圖的觀察指標

本實驗對心肌缺血程度的觀察指標主要定為J點位移。J點位移測量以P-R段為基線，每時間點測5個連續(xù)波形，取其平均值。記錄并計算J點位移的變化值，無論升高或降低，取變化的絕對值，結果見表1。莪達夏高、中、低劑量可使結扎冠狀動脈所致缺血再灌注損傷大鼠的導聯心電圖ST段的升高明顯降低，與模型組相比有顯著性差異。

表1 各組心電圖ST段變化的比較(n=10，±s )Tab 1 The comparison of the ST waves among groups(n=10,±s )

表1 各組心電圖ST段變化的比較(n=10，±s )Tab 1 The comparison of the ST waves among groups(n=10,±s )

注：與模型組比較，1)P＜0.05，2)P＜0.01Note: Compare with the model group,1)P＜0.05,2)P＜0.01

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2.5 NOS、iNOS活性以及NO含量測定

操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行，結果見表2。與正常對照組比較，缺血再灌注模型組大鼠心肌組織中，總NOS 和iNOS活性明顯增強，伴有心肌NO水平顯著增高。高、中、低3個劑量組中，隨著給藥劑量的逐漸增高，總NOS和iNOS活性明顯減弱，NO水平顯著降低。

表2 各組大鼠心肌缺血再灌注后心肌組織NO、NOS、iNOS含量的變化(n=10，x±s )Tab 2 The concentration changes of NO, NOS, iNOS among groups after myocardial ischemia-reperfusion injury (n=10,x±s )

2.6 組織形態(tài)學觀察

實驗結束后留取左心室肌，快速放入4%戊二醛固定液固定處理。制片時取各組樣品3個，分別固定于1/15 mol·L-1磷酸緩沖液(PBS)配制的3%戊二醛固定液2 h；PBS液漂洗3次，每次10 min；1%鋨酸固定1.5 h，PBS液漂洗3次，每次10 min；50%，70%，80%，90%，100%梯度脫水，每次10 min；純丙酮脫水2次，每次10 min；EPON-812環(huán)氧樹脂-純丙酮(1∶1)浸透2 h；EPON-812環(huán)氧樹脂包埋，35 ℃，24 h；45 ℃，24 h；65 ℃，24 h聚合；半薄切片，甲苯胺藍染色，光鏡下定位，超薄切片，透射電子顯微鏡觀察，記錄。每組均取放大倍數為10 000倍，隨機用CCD相機采集7～10張做為定量之用，并對每組較典型的正?；虍惓Ｐ募〕⒔Y構進行底片照相，并做定性觀察，結果見圖1。與正常對照組比較，缺血再灌注模型組組織形態(tài)學觀察可見肌原纖維內大量收縮帶，肌質網擴張，肌纖維內脂滴增多，心肌細胞連接處電子密度降低，肌絲排列稀疏，潤盤解離，局部肌纖維內線粒體腫脹嵴疏松，部分嵴消失，心肌細胞損傷嚴重。

圖1 各組大鼠心肌缺血再灌注后超顯微結構變化(10 000×) A-模型組；B-假手術組；C-低劑量組；D-中劑量組；E-高劑量組；F-對照組Fig 1 The comparison of the myocardial ischemia-reperfusion injury ultrastructure among groups(10 000×) A-ischemia and reperfusion model group; B-sham operation; C-low dose; D-middle dose; E-high dose; F-control group

3 討論

急性心肌缺血是造成心臟性猝死的主要原因，而一定時間缺血后再灌注不但加重心肌損傷，還可造成致命性心律失常。缺血再灌損傷的機制也較為復雜，參與因素眾多。NO是生物體內重要的信使分子和效應分子，具有神經介質和調質的功能，廣泛參與體內生理和病理活動。其在心肌缺血再灌注損傷中的作用受到高度重視，但是NO在心肌缺血再灌注中是起保護因子作用抑或是起細胞毒性作用目前尚有爭議，NO可能發(fā)揮損傷或保護的雙重作用[11]，一些研究發(fā)現，NO釋放減少與許多心血管病的發(fā)生發(fā)展有關，如心絞痛、心肌梗死、高血壓等。另一些研究則表明NO生成過多對心血管系統(tǒng)也有顯著的不良作用，對心肌細胞具有損傷作用[12-13]。NOS是NO合成的關鍵酶，可分為3種類型：神經元型(nNOS)，內皮結構型(eNOS)，誘導型(iNOS)。nNOS與eNOS的激活均依賴于鈣離子和鈣調蛋白的作用。iNOS可由炎癥因子、內毒素等誘導激活，作用時間長，可催化生成大量NO。心肌和血管內皮細胞都能夠表達iNOS，在心力衰竭、擴張性心臟病、缺血性心臟病時iNOS表達增加，體內的一些活性物質如兒茶酚胺、血管緊張素Ⅱ都能夠促進和維持iNOS的表達[14-16]。本實驗結果顯示，與對照組比較，缺血再灌注模型組大鼠心肌組織中，總NOS和iNOS活性明顯增強，伴有心肌NO水平顯著增高，組織形態(tài)學觀察可見肌原纖維內大量收縮帶，肌質網擴張，肌纖維內脂滴增多，心肌細胞連接處電子密度降低，肌絲排列稀疏，潤盤解離，局部肌纖維內線粒體腫脹嵴疏松，部分嵴消失，心肌細胞損傷嚴重。本實驗證實了心肌缺血再灌注后總NOS尤其是iNOS活性增強，從而釋放NO，過量的NO導致了心肌缺血損傷，支持了NO升高可能是加重心肌缺血再灌注損傷的因素。莪達夏水提物高、中劑量組和心得安組大鼠心肌中總NOS和iNOS活性明顯較低，高劑量組和心得安組NO水平顯著降低。高、中、低劑量組電鏡下心肌超微結構觀察也進一步證實心肌損傷隨劑量增高而減輕顯著，線粒體基本趨向正常，提示莪達夏可能通過抑制心肌NOS活性，減少產生過量NO，從而削弱了對心肌細胞損傷的作用，這與王超等的研究結果相一致：NO、NOS在心肌缺血再灌注過程中起著雙重作用，可能在不同的動物、組織，在不同的缺血再灌注時其含量、活性及病理生理效應是不同的，NO供體、NO前體藥物及NOS抑制劑如果合理使用均可起到心肌保護作用[17-18]。NO介導心肌損傷的機制可能主要與過氧化亞硝酸陰離子有關，Wang等[19]在離體大鼠心肌缺氧再氧合模型中，對NO超氧陰離子及過氧化、亞硝酸陰離子的過程變化進行了研究，發(fā)現它們在再灌注早期同步升高，L-硝基精氨酸甲酯(L-NAME)可使NO水平明顯下降，同時過氧化亞硝酸陰離子的生成也明顯減少，左室功能改善，過氧化亞硝酸陰離子可能是引發(fā)再灌注損傷因素，L-NAME通過降低NO水平，減少過氧化亞硝酸陰離子的生成，而起到心肌保護作用[20]。研究結果顯示，心肌缺血再灌注后，心肌組織中NO和NOS含量明顯增加。

REFERENCES

[1] Institute of Tibetan Medicine in Tibet Autonomous Region. The Chinese Herbal Medicine(中華本草藏藥卷) [M]. Shanghai: Shanghai Scientific and Technical Publishers, 2002: 3313-3314.

[2] ZHAO Y, TONG L, CHEN S L, et al. The effects of Oxytropis falcate Bunge ethanol extract on the proliferation and apoptosis of the human hepatoma cell [J]. Prog Vet Med(動物醫(yī)學進展), 2009, 30(10): 15-18.

[3] WANG D, YANG H, YANG G M, et al. Volatile compositions from a Tibetan medicine: Oxytropis falcate Bunge [J]. Nat Prod Res Dev(天然產物研究與開發(fā)), 2010, 22(4): 614-619.

[4] CHENG H Y, TONG L, CHEN X H, et al. Extraction and content determination of polysaccharide from Tibetan herbal medicine Oxytropis falate Bunge [J]. J Anhui Agri Sci(安徽農業(yè)科學), 2009, 37(23): 10989, 10992.

[5] HUO X H, ZHAO B Y, WANG J J, et al. Preliminary chemical test of Oxytropis falcate Bunge and alkaloids analysis by TLC [J]. Acta Agriculturae Boreali-occidentalis Sinica(西北農業(yè)學報), 2008, 17(2): 24-28, 32.

[6] LI Z Y, ZHAO L Y. Nitric oxide and cardiovascular disease [J]. Chin J Cardiol(中華心血管病雜志), 1996, 24(1): 73-76.

[7] BOLLI R. Cardloprotective function of inducible nitric oxide synthase and role of nitric oxide in myoeardial ischemia and preconditioning: an overview of a decade of research [J]. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33(11): 1897-1918.

[8] TAKANO H, TANG X L, QIU Y M, et al. Nitric oxide donors induce late preconditioning against myocardial stunning and infarction in conscious rabbits via an antioxidant-sensitive mechanism [J]. Circ Res, 1998, 83(1): 73-84.

[9] TONG L, YUAN D P, LI W Y, et al. Experimental study on the anti-inflammatory, analgesic actions of Oxytropis falcate Bunge [J]. J Sichuan Tradit Chin Med(四川中醫(yī)), 2008, 26(1): 53-55.

[10] KOU Y Y. The protective effects and mechanisms of Sanwei Tanxiang powder against myocardial ischemia and reperfusion injury of rats [D]. Lanzhou: Lanzhou University, 2008.

[11] WANG Y, WANG S X, JIANG Z H, et al. Effects of formula narcose dogs on iNOS mRNA expression of rats during myocardial ischemia and reperfusion [J]. Liaoning J Tradit Chin Med(遼寧中醫(yī)雜志), 2007, 34(12): 1811-1814.

[12] BERGES A, VAN N L, BOSMANS J, et al. Role of nitric oxide and oxidative stress in ischaemic myocardial injury and preconditioning [J]. Acta Cardiol, 2003, 58(2): 119-132.

[13] BRADY A J, WARREN J B, POOLE-WILSON P A, et al. Nitric oxide attenuates cardiac myocyte contraction [J]. Am J Physiol, 1993, 265(1 Pt 2): 176-182.

[14] MONCADA S, PALMER R M, HIGGS E A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology [J]. Pharmacol Rev, 1991, 43(2): 109-142.

[15] KELLY R A, BALLIGAND J L, SMIHT T W. Nitric oxid and cardiac function [J]. Circ Res, 1996, 79: 363-380.

[16] BRADY A J, POOLE WILSON P A, HARDING S E, et al. Nitric oxide production within cardiac myocytes reduces their contractility in endotoxemia [J]. Am J Physiol, 1992, 263 (6 Pt 2): 1963-1966.

[17] WANG C, CHANG X R. Reviews on the effects of NO and NOS respectively in myocardial ischemical reperfusion injury and interfered by TCM and acupuncture [J]. Hunan Guiding J Tradit Chin Med Pharmacol(湖南中醫(yī)藥導報), 2002, 8(12): 738-741.

[18] CUI S T, ZHU H S. Myocardial ischemic reperfusion injury affected by the isozymes of nitric oxide synthase and their gene expression: experimental study [J]. Natl Med J China(中華醫(yī)學雜志), 1998, 78(5): 327-330.

[19] WANG P, ZWEIER J L. Measurement of nitric oxide and peroxynitrite generation in the postischemic heart. Evidence for peroxynitrite-mediated reperfusion injury [J]. J Biolchem, 1996, 271(46): 29223-29230.

[20] YAN J, TIAN Y F, LIU J H, et al. Effects of electroacupuncture at neiguan points on nitric oxide and nitric oxide synthases after myocardial lschemia and reperfusion injury [J]. China J Basic Med Tradit Chin Med(中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志), 2002, 8(7): 68-70.

Influence of Oxytropis Falcate Bunge on NO and NOS of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury in Rats

ZHANG Dejun1,2, DU Hen1, LIU Mingcheng2, LI Fu’an1, LU Dianxiang1, MA Jianbin3
(1.Medical College of Qinghai University, Xining 810001, China; 2.College of Eco-Environmental Engineering, Qinghai University, Xining 810016, China; 3.Qinghai Normal University of Biology and Geogrpahy Science, Xining 810008, China)

OBJECTIVE To study the influence of Oxytropis falcate Bunge on the content of NO, and the activities of NOS and iNOS in myocardial ischemia and reperfushon injury rats to explore its possible protective mechanism in vivo. METHODS The model of myocardial ischemia reperfusion injury in rats was employed by ligating the artery of left anterior descending. After the following reperfusion for 40 minutes, the concentration of NO and the enzymatic activities of NOS, iNOS in rats’myocardial tissue were tested. RESULTS The results showed that the enzymatic activities of NOS, iNOS and the concentration of NO of myocardial tissue in ischemia-reperfusion model group were much higher than that of normal control group. The enzymatic activity of NOS, iNOS and the concentration of NO of myocardial tissue in test groups were lower than that of model group. CONCLUSION Oxytropis falcate Bunge plays protection effects during acute myocardial ischemia-reperfusion injury in rats in vivo by decreasing the enzymatic activity of NOS, iNOS and the concentration of NO.

Oxytropis falcate Bunge; myocardial ischemia-reperfusion injury; NO; NOS

R965.2

A

1007-7693(2013)10-1054-05

2013-01-05

青海省科技廳項目(2011-Z-704)；教育部“春暉計劃”科研項目(Z2011021)

張得鈞，男，博士，教授 Tel: (0971)5312936 E-mail: djzhang@nwipb.ac.cn