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    七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性及藥效學(xué)研究

    2013-03-06 08:29:01覃瑤陽(yáng)勇龔曉麗李紫薇趙嘉將羅維早
    關(guān)鍵詞:皂苷鈉微乳耳廓

    覃瑤,陽(yáng)勇,龔曉麗,李紫薇,趙嘉將,羅維早*

    (1.太極集團(tuán)有限公司,重慶 401147;2.重慶市中藥研究院,重慶 400065;3.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所,成都 610041;4.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016)

    ·論 著·

    七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性及藥效學(xué)研究

    覃瑤1,2,陽(yáng)勇2,龔曉麗3,李紫薇4,趙嘉將1,羅維早1,2*

    (1.太極集團(tuán)有限公司,重慶 401147;2.重慶市中藥研究院,重慶 400065;3.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中醫(yī)研究所,成都 610041;4.重慶醫(yī)科大學(xué),重慶 400016)

    目的 對(duì)市售七葉皂苷鈉粉針及自制七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性和療效進(jìn)行對(duì)比研究。方法 以新西蘭家兔為試驗(yàn)用動(dòng)物,進(jìn)行溶血試驗(yàn)和血管刺激性試驗(yàn),對(duì)用藥安全性進(jìn)行考察;對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹及耳廓毛細(xì)血管通透性增加的抑制作用進(jìn)行考察,作出初步藥效學(xué)評(píng)價(jià)。結(jié)果 市售粉針和自制微乳劑均有輕微的溶血和一定的刺激性,組間無(wú)明顯差別;高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及微乳注射劑對(duì)二甲苯所致小鼠耳腫脹及耳廓毛細(xì)血管通透性增加均有明顯的拮抗作用,其中七葉皂苷鈉微乳注射劑的拮抗作用更為明顯。結(jié)論 市售粉針劑和自制微乳注射劑均存在一定的靜脈注射安全性風(fēng)險(xiǎn),兩者抗炎消腫作用明顯,七葉皂苷微乳注射劑療效更為顯著。

    注射用七葉皂苷鈉;微乳劑;安全性;有效性

    七葉皂苷鈉為七葉樹(shù)科植物天師栗的干燥成熟果實(shí)(娑羅子)提取得到的皂苷鈉鹽,主要成分是七葉皂苷,屬于三萜皂苷類藥物[1]。七葉皂苷不溶于水,其鈉鹽具有很好的水溶性。七葉皂苷鈉具有顯著的抗炎消腫功能,臨床用于多種疾病的治療。市售劑型主要有片劑、粉針劑、凝膠劑,其中七葉皂苷鈉粉針應(yīng)用最為廣泛,但其靜脈給藥對(duì)血管刺激性大,可致靜脈疼痛和靜脈炎[2]。微乳是一種新型理想的藥物釋放載體,具有透明、穩(wěn)定、吸收完善和靶向釋藥等特點(diǎn),能夠提高藥物儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和生物利用度,并能提高療效。同時(shí),微乳對(duì)炎癥病灶具有一定的趨向性,微乳的相關(guān)輔料已有注射用標(biāo)準(zhǔn),使其新藥開(kāi)發(fā)前景樂(lè)觀,臨床應(yīng)用價(jià)值日益提高[3]。因此,本研究將七葉皂苷鈉在酸性條件下制備成注射用水包油型微乳劑型。在此條件下,七葉皂苷鈉游離為七葉皂苷,脂溶性顯著增加溶于油相,降低了水相中的含量,從而降低了與血管壁接觸的機(jī)會(huì),減少對(duì)血管壁的刺激,增強(qiáng)患者用藥的安全性。同時(shí)借助微乳對(duì)炎癥病灶的趨向性,以期提高藥物在炎癥病灶的濃集,增加療效。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器設(shè)備

    JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海智光儀器儀表有限公司);萬(wàn)分之一電子分析天平(德國(guó)賽多利斯);DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司);電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業(yè)儀器有限公司);BS224電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)公司);756PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);Allegra X-12離心機(jī)(美國(guó)貝爾曼庫(kù)爾特有限公司);LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)。

    1.2 供試品溶液

    七葉皂苷鈉微乳注射劑(自制,2 mg·mL-1);注射用七葉皂苷粉針(武漢愛(ài)民制藥有限公司,批號(hào):1111078,規(guī)格:10 mg·瓶-1);實(shí)驗(yàn)時(shí)均用0.9%生理鹽水配制成適當(dāng)濃度對(duì)動(dòng)物尾靜脈注射給藥。

    1.3 試劑

    二甲苯(重慶川東化工集團(tuán)有限公司,批號(hào):20091020);伊文思蘭(B.D.H進(jìn)口分裝產(chǎn)品,實(shí)驗(yàn)時(shí)用無(wú)菌生理鹽水配制成0.5%的溶液);丙酮[重慶川東化工(集團(tuán))有限公司化學(xué)試劑廠,批號(hào):20091118];生理鹽水(重慶天圣制藥股份有限公司,批號(hào):090804)。

    1.4 動(dòng)物

    新西蘭家兔,普通級(jí),體質(zhì)量2.0~2.5 kg,♀♂各半,由四川省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):0044303;KM小鼠,♀♂各半,體質(zhì)量18~22 g,由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(渝)20070006。

    2 方法和結(jié)果

    2.1 溶血試驗(yàn)

    取新西蘭家兔,耳緣靜脈取血約15 mL,用玻棒輕輕攪動(dòng)血液以除纖維蛋白原,使成脫纖血液[4]。加入生理鹽水約10倍量,搖勻,2 000 r·min-1離心10 min,除去上清液,沉淀的紅細(xì)胞再用生理鹽水按上述方法洗滌3~4次,直至上清液不顯紅色為止,按所得紅細(xì)胞容積用生理鹽水配成2%兔血紅細(xì)胞混懸液,備用。取潔凈試管7支,1~5號(hào)管為供試品,按表1依次加入2%兔血紅細(xì)胞混懸液、生理鹽水、注射用七葉皂苷鈉微乳注射劑(5 mL溶于生理鹽水125 mL)、七葉皂苷鈉粉針液(5 mg溶于生理鹽水250 mL);6號(hào)管為陰性對(duì)照;7號(hào)管為陽(yáng)性對(duì)照?;靹騦~7號(hào)管,置(37±0.5)℃恒溫水浴箱中溫育。3 h后觀察溶血與凝集現(xiàn)象,按表2判斷是否溶血,結(jié)果見(jiàn)表3。

    表1 注射用七葉皂苷鈉微乳溶血試驗(yàn)加樣表Tab 1 The sample loading amount of hemolysis test about sodium aescinat micro-emulsion injection

    表2 溶血試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)Tab 2 Judging criteria of hemolysis test

    表3 注射用七葉皂苷鈉微乳溶血試驗(yàn)結(jié)果Tab 3 Hemolysis results of sodium aescinat micro-emulsion injection

    結(jié)果表明,7號(hào)陽(yáng)性對(duì)照管液體澄明鮮紅色,管底幾乎無(wú)紅細(xì)胞殘留,為全溶血;6號(hào)陰性對(duì)照管上層液無(wú)色澄明,紅細(xì)胞逐漸沉于管底,顏色呈鮮紅色,輕輕振搖后管底沉積的紅細(xì)胞均能完全分散,為無(wú)溶血;兔血紅細(xì)胞的1~4號(hào)各濃度七葉皂苷鈉微乳供試管、5號(hào)七葉皂苷鈉粉針供試管上層溶液呈澄明紅色,管底有少量紅細(xì)胞殘留,輕搖后紅細(xì)胞不能完全分散,表明部分溶血[5]。但注射用七葉皂苷鈉微乳與七葉皂苷鈉粉針供試管比較,無(wú)明顯差別。

    2.2 血管刺激性試驗(yàn)

    取新西蘭家兔6只,隨機(jī)分成2組。第1組按0.6 mg·kg-1家兔右耳注射七葉皂苷鈉粉針注射劑(5 mg溶于生理鹽水10 mL);第2組注射等給藥體積的生理鹽水作自身陰性對(duì)照,2組分別左耳緣靜脈注射七葉皂苷鈉微乳注射劑(5 mL溶于生理鹽水20 mL)。每天1次,連續(xù)給藥5 d,肉眼觀察注射部位及周圍組織是否有紅腫、充血等刺激現(xiàn)象。末次給藥后24 h,于注射部位及周圍組織處拔毛,75%乙醇消毒,恢復(fù)3 h以上。按30 mg·kg-1注射戊巴比妥鈉局部麻醉,沿注射部位1 cm開(kāi)始取0.5 cm組織,取多段,各間隔1 cm,生理鹽水沖洗,用10%中性福爾馬林液固定24 h。常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下組織學(xué)檢查并比較[6]。結(jié)果見(jiàn)圖1。

    圖1 血管刺激性試驗(yàn)病理圖片A-生理鹽水;B-七葉皂苷鈉粉針;C-注射用七葉皂苷鈉微乳Fig 1 Pathology photos of vascular stimulation test A-saline; B-sodium aescinat powder injection; C-sodium aescinat micro-emulsion injection

    圖1 結(jié)果表明,注射生理鹽水組,3只家兔耳緣靜脈無(wú)明顯充血,血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整,無(wú)腫脹、變性、壞死及增生,管壁及周圍組織無(wú)炎癥改變。耳廓皮膚表面復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞無(wú)水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變,無(wú)炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無(wú)特殊病變。中心部位彈性軟骨形態(tài)正常,軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及軟骨膜結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)正常。耳廓間質(zhì)纖維組織無(wú)增生及變性,無(wú)急性及慢性炎癥改變[7]。

    七葉皂苷鈉粉針組的3只家兔耳緣靜脈充血明顯,血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹,管壁周圍組織有出血以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。耳廓皮膚表面復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞無(wú)水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變,無(wú)炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無(wú)特殊病變。中心部位彈性軟骨形態(tài)正常,軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及軟骨膜結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)正常。耳廓間質(zhì)纖維組織無(wú)增生及變性,無(wú)急性及慢性炎癥改變。

    注射用七葉皂苷鈉微乳注射的3只家兔的耳緣靜脈充血,血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹,管壁周圍組織有出血以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。耳廓皮膚表面復(fù)層鱗狀上皮結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞無(wú)水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變,無(wú)炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無(wú)特殊病變。中心部位彈性軟骨形態(tài)正常,軟骨細(xì)胞、軟骨基質(zhì)及軟骨膜結(jié)構(gòu)和染色反應(yīng)正常。耳廓間質(zhì)纖維組織無(wú)增生及變性。與生理鹽水對(duì)照組比較,有顯著的病理組織學(xué)差異。

    2.3 對(duì)二甲苯致耳腫脹的抑制作用

    對(duì)小鼠耳腫脹模型靜脈注射給藥,有效劑量擬定為0.9 mg·kg-1(低劑量組)、4.5 mg·kg-1(高劑量組)。將50只小鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為陰性對(duì)照組、七葉皂苷鈉粉針組和七葉皂苷鈉微乳注射劑組,每組10只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后,七葉皂苷鈉微乳注射劑組及七葉皂苷鈉粉針組均分別按劑量靜脈注射給藥,陰性對(duì)照組靜脈注射0.2 mL生理鹽水。給藥后30 min,在每鼠右耳涂上二甲苯(0.03 mL·只-1)。15 min后處死動(dòng)物,用直徑為0.6 cm的打孔器在相同位置取兩耳片稱重,以兩耳片之差為腫脹度[8]。結(jié)果見(jiàn)表4。

    表4 對(duì)二甲苯致耳腫脹的抑制作用(n=10)Tab 4 Inhibitory effect on xylene-induced mouse ear edema (n=10)

    結(jié)果表明,與陰性對(duì)照組比較,高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及注射用七葉皂苷鈉微乳對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹均有明顯的抑制作用;其中七葉皂苷鈉微乳的效果更為明顯。

    2.4 對(duì)二甲苯致毛細(xì)血管通透性增加的拮抗作用選50只健康小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),按“2.3”項(xiàng)下進(jìn)行動(dòng)物分組、劑量設(shè)計(jì),小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)后,注射用七葉皂苷鈉微乳組及陽(yáng)七葉皂苷鈉粉針組均分別按劑量靜脈注射給藥,陰性對(duì)照組靜脈注射0.2 mL生理鹽水。給藥后30 min,每只動(dòng)物尾靜脈注射0.2 mL 0.5%伊文思藍(lán)生理鹽水溶液,立即在每鼠右耳涂二甲苯(0.03 mL·只-1)。15 min后處死動(dòng)物,用直徑為0.6 cm的打孔器在相同位置取右耳片,剪碎,置盛有4 mL丙酮:生理鹽水(7∶3)的有塞試管內(nèi),浸泡96 h。離心,傾出上清液于590 nm比色,以吸光度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì),結(jié)果見(jiàn)表5。

    表5 對(duì)二甲苯致毛細(xì)血管通透性增加的拮抗作用(n=10)Tab 5 The antagonism on xylene-induced capillary permeability-increasing(n=10)

    結(jié)果表明,當(dāng)二甲苯涂小鼠右耳,因刺激作用導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性增加,吸光度和毛細(xì)血管通透性成正比。與陰性對(duì)照組相比,高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及七葉皂苷鈉微乳注射劑對(duì)二甲苯引起的小鼠耳廓毛細(xì)血管通透性增加均有明顯的拮抗作用。七葉皂苷鈉微乳注射劑的拮抗作用更為明顯。

    3 討論

    3.1 安全性

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七葉皂苷鈉微乳注射劑和七葉皂苷鈉粉針注射劑家兔靜脈給藥有部分溶血和血紅細(xì)胞凝聚反應(yīng),且有血管刺激性反應(yīng),七葉皂苷微乳注射劑的充血現(xiàn)象略弱于七葉皂苷粉針劑,但無(wú)顯著差異,提示該藥物本身靜脈注射給藥存在一定風(fēng)險(xiǎn)性,還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究七葉皂苷鈉引起溶血和血管刺激性反應(yīng)的原因。

    3.2 有效性

    實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及七葉皂苷鈉微乳注射劑對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹及耳廓毛細(xì)血管通透性增加均有明顯的抑制作用,其中七葉皂苷鈉微乳的效果更為明顯,為后續(xù)研究提供了一定的基礎(chǔ)。粉針組與微乳注射劑間無(wú)顯著性差異,其原因可能在于七葉皂苷鈉自身的抗炎效果較為明顯,故其組間差異難以分析。

    本次對(duì)七葉皂苷鈉粉針劑和微乳注射劑的安全性及藥效學(xué)的對(duì)比研究中,市售粉針和自制微乳劑均有輕微的溶血和一定的刺激性。溶血和刺激性可能還源于主藥七葉皂苷鈉本身,也可能源于微乳劑中的乳化劑和助乳化劑等輔料[9],其注射用安全性還有待進(jìn)一步的考察。自制微乳劑較市售粉針劑有明顯的抗炎消腫作用,可能是選用有雙親性的微乳作為藥物載體,避免了藥物與血管壁的直接接觸,增加了藥物在炎癥部位的富集,從而使其抗炎消腫作用增強(qiáng)[10]??偠灾⑷樽鳛橐环N新型藥物載體,穩(wěn)定、吸收迅速完全、能增強(qiáng)療效,如能降低其不良反應(yīng),其制劑有很大潛力。隨著研究的深入,微乳中藥制劑將有更廣闊的發(fā)展前景。

    REFERENCES

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    [4] ZHANG Y F, ZHAO X X, XIN Z W. Experiment studies of Maodongqing injection on vascular stimulation, haemocytolysis and anaphylaxis [J]. China Pract Med(中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥), 2012, 7(23): 64-65.

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    [7] QU J. The evaluation on safety of Chinese medicine injection [J]. Chin Hosp Pharm J(中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志), 2009, 29(2): 93-98.

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    [10] ZHANG L, ZHOU Q H, Lü X, et al. The preparationn of microemulsion and its application in pharmacy of Chinese herbal medicine [J]. Acta Chin Med Pharmacol(中醫(yī)藥學(xué)報(bào)), 2007, 35(6): 37-39.

    Study on the Safety and Pharmacodynamics of Sodium Aescinat Micro-emulsion Injection

    QIN Yao1,2, YANG Yong2, GONG Xiaoli3, LI Ziwei4, ZHAO Jiajiang1, LUO Weizao1,2*
    (1.Taiji Group, Chongqing 401147, China; 2.Chongqing Institute of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400065, China; 3.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China; 4.Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

    OBJECTIVE To undertake a contrastive study on safety and pharmacodynamics of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection. METHODS New Zealand rabbits were chosen as experimental animals for hemolysis and vascular stimulation tests, and its safety for therapy was probed. Investigate the inhibitory effect on xylene-induced mouse ear edema and capillary permeability-increasing, and a preliminary pharmacodynamics evaluation was made. RESULTS Both of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection had slight hemolysis and stimulation, there was no evident difference between the two groups; both groups of high dose and low dose sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection had remarkable restrictive effect on mouse ear edema and capillary permeability-increasing, the antagonistic action of micro-emulsion injection was more apparent. CONCLUSION Both of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection have a certain intravenous security risk, and they also have significant anti-inflammatory effects, the anti-inflammatory effects of sodium aescinat micro-emulsion injection is more apparent.

    sodium aescinat for injection; micro-emulsion for injection; safety; validity

    R965.3

    A

    1007-7693(2013)10-1043-04

    2013-03-07

    國(guó)家自然科學(xué)基金(81073062);重慶市中藥產(chǎn)業(yè)“重構(gòu)提升”行動(dòng)科技攻關(guān)項(xiàng)目

    覃瑤,女,博士 Tel: 13527482150 E-mail: trowa1982@126.com*

    羅維早,男,研究員 Tel: 18623088135 E-mail: loweizao@163.com

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