LEF1在脫甲基化藥物DAC和紫杉醇聯(lián)合治療腎癌中的作用分析

孫式偉，李 遠，趙春利，尚東浩

（1.河北大學(xué)附屬石油物探中心醫(yī)院泌尿外科，河北徐水072555；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊050011；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，河北保定071000；4.北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京100050）

LEF1在脫甲基化藥物DAC和紫杉醇聯(lián)合治療腎癌中的作用分析

孫式偉1，李 遠2*，趙春利3，尚東浩4

（1.河北大學(xué)附屬石油物探中心醫(yī)院泌尿外科，河北徐水072555；2.河北省石家莊市第四醫(yī)院內(nèi)科，河北石家莊050011；3.河北大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，河北保定071000；4.北京友誼醫(yī)院泌尿外科，北京100050）

目的研究淋巴增強因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1）基因在脫甲基化藥物5-氮-2-脫氧胞苷（5-aza-2′-deoxycytine，DAC）聯(lián)合紫杉醇（paclitaxel，PTX）治療（renal cell carcinoma，RCC）中發(fā)揮協(xié)同作用的機制。方法應(yīng)用定量PCR測定二者聯(lián)合應(yīng)用時LEF1 mRNA表達量變化。2種腎癌細胞株ACHN、NC65分別用DAC：0.5、1、2、4、8μmol/L；PTX：1、2、4、8、16nmol/L；DAC（1、2μmol/L）＋PTX（1、2、4、8、16nmol/L）處理3d。Rneasy mini kit（Qiagen）抽提t(yī)RNA，F(xiàn)irst strand cDNA synthesis kit（Amasham Pharmacia）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1條鏈，Realtime PCR采用SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）進行擴增，IQ5進行熒光定量分析。結(jié)果通過Real-time PCR測定出DAC與PTX 2種藥物聯(lián)合應(yīng)用時LEF1下降，且顯著低于PTX或DAC單劑作用效果。結(jié)論應(yīng)用Real-time PCR進行了驗證，LEF1是DAC和PTX治療腎癌相乘作用中的重要靶基因。

腎腫瘤；脫氧胞苷；紫杉醇

腎癌又稱腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC），約占腎臟腫瘤的85％，是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一。許多研究表明RCC是最對藥物抵抗（therapy-resisstant）的惡性腫瘤之一，其對化學(xué)治療、激素治療及放射治療都反應(yīng)較低或不反應(yīng)。近年來研究［1］發(fā)現(xiàn)脫甲基化藥物5-氮-2-脫氧胞苷（5-aza-2′-Deoxycytidine，DAC）與聯(lián)合紫杉醇（paclitaxel，PTX）作用于腎癌細胞株時，對其生長具有抑制作用，且呈現(xiàn)劑量依賴性。而當(dāng)DAC與PTX 2種藥物聯(lián)合應(yīng)用時，生長抑制率顯著高于PTX單劑作用效果，呈現(xiàn)相乘作用。我們在DAC聯(lián)合PTX處理腎癌細胞株后的基因芯片實驗中已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)，淋巴增強因子1（lymphoid enhancer-binding factor 1，LEF1）基因表達發(fā)生了明顯變化。本實驗進一步以定量PCR方法確認DAC與PTX聯(lián)合處理腎癌細胞株后LEF1表達水平的變化，驗證基因芯片的結(jié)果，從而為DAC聯(lián)合PTX的個性化治療進行必要的探索。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑：受試物，DAC和PTX 2種主要化療藥物均購自于Sigma，濾過滅菌。RPMI-1640培養(yǎng)基，美國GIBCO。四甲基偶氮唑鹽（MTT），美國Sigma。二甲基亞砜DMSO，美國Keh。胎牛血清，美國GIBCO。胰蛋白酶，美國GIBCO。PBS，中國惠澤奧。細胞凍存液，中國惠澤奧。TRIzol，美國Invitrogen。LEF1及GAPDH引物，購置上海生工生物工程公司，LEF1（5′-3′）Fw，AAATAAAGTGCCCGTGGTGC；Rv，CATGCCTTGTTTGGAGTTGACA。GAPDH（5′-3′）Fw，ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG；Rv，GTGGAGGAGTGGGTGTCGC。

1.2 試劑配制：①雙抗儲存液，80萬U/瓶青霉素注射液用無菌生理鹽水稀釋成40mL，100萬U/瓶鏈霉素注射液用無菌生理鹽水稀釋成50mL，再分別取40mL青霉素稀釋液與40mL鏈霉素稀釋液混合而成，凍存保藏。②胎牛血清，56℃水浴30 min滅活，混勻后分裝，－20℃保存。③MTT液（5g/mL），取250 mg MTT，溶于50mL 0.01mol/L PBS（pH7.2）溶液中，用磁力攪拌器攪拌30min，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，－20℃避光保存。④0.25％胰蛋白酶溶液，稱取胰蛋白酶干粉0.5g，溶解于200mL PBS液中，完全溶解后，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。⑤磷酸鹽緩沖液，PBS粉溶解于800mL三蒸水中，磁力攪拌器上攪拌15min，待完全溶解后，定容到1000mL，高壓蒸氣滅菌，4℃保存。⑥RPMI-1640培養(yǎng)液，RPMI-1640干粉加800mL三蒸水?dāng)嚢?、充分溶解后定容?000mL，用0.22μm微孔濾膜過濾除菌，分裝，4℃保存。

1.3 主要實驗儀器：超凈工作臺，日本Isocide。CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo Forma。生物光學(xué)顯微鏡，德國Olympus。自動平衡離心機，日本Kubota。550型酶標(biāo)儀，美國Thermo Forma。－80℃超低溫冰箱，美國Revco。Real-time PCR儀，美國Bio-Rad。高壓蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司。磁力加熱攪拌器，金壇市杰瑞電器有限公司。臺式低速離心機，上海醫(yī)療器械集團有限公司手術(shù)器械廠。液氮罐，美國Thermo。小型高速臺式離心機，德國Sigma。紫外分光光度計，英國Picodrop。pH計，德國Sartorius。0.22μm微孔濾膜，Nippon Millipore Ltd。96孔細胞培養(yǎng)板，美國corning公司。Levo Plus大容量電動移液器，0.1～100mL，大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司。單道數(shù)字可調(diào)移液器（Research）10～100μL。單道數(shù)字可調(diào)移液器（Research）20～200μL。單道數(shù)字可調(diào)移液器（Research）100～1000μL。德國艾本德股份公司（Eppendorf AG）。微量振蕩器，上海創(chuàng)發(fā)儀器有限公司。手動連續(xù)移液器（連續(xù)加樣器），德國BRAND。普通冰箱，海爾公司。垂直電泳槽，美國Bio-Rad（20）電子天平，梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司。

1.4 細胞株：本研究中的2種腎癌細胞株ACHN、NC65，均為腎透明細胞癌，均由日本京都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科提供。

1.5 方法

1.5.1 樣品的配制：將PTX溶于DMSO中，濃度為10g/L，再用無血清RPMI-1640將樣品配制成1g/L的儲備液，放至－80℃冰箱儲藏待用。使用前用RPMI-1640完全培養(yǎng)液將其稀釋成濃度分別為1000、100、10、1、0.1mg/L的樣品液，混勻后備用；受試物配置：DAC，500μmol/L終濃度液體，PBS稀釋，0.22μm濾膜過濾除菌，－80℃保存。PTX，500nmol/L終濃度液體，PBS稀釋，0.22μm濾膜過濾除菌，－80℃保存。

1.5.2 細胞復(fù)蘇，培養(yǎng)及藥物處理：①細胞復(fù)蘇，ACHN、NC65 2種腎透明細胞癌細胞株均保存于－80℃液氮中。復(fù)蘇時迅速取出凍存管，置于37℃水箱中水浴，使其快速解凍。然后在超凈臺上小心打開凍存管，用吸管從管內(nèi)吸出細胞懸液，注入含有RPMI-1640培養(yǎng)液的移液管中，1 500 r/min，離心5min，去掉上清后，加入Rpmi-1640培養(yǎng)基液，輕微混勻，移至直徑10cm的培養(yǎng)皿中。置于5％CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。②細胞培養(yǎng)：細胞培養(yǎng)基為完全培養(yǎng)基（含10％胎牛血清，RPMI-1640，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素），5％CO2的37℃培養(yǎng)箱中孵育，腎癌細胞株ACHN和NC65均為單層黏壁生長類型，融合度保持不超過80％。將細胞培養(yǎng)為濃度為1×107個/mL，光鏡直接玻片法計數(shù)。③腎癌細胞株處理，2種腎癌細胞株ACHN、NC65分別用DAC：0.5、1、2、4、8μmol/L；PTX：1、2、4、8、16nmol/L；DAC（1、2μmol/L）＋PTX（1、2、4、8、16nmol/L）處理3d。

1.5.3 定量PCR：①樣品RNA抽提，分別對腎癌細胞株ACHN、NC65約取1×106～1×107細胞，加1mL RNA抽提試劑TRIzol（樣品為貼壁細胞，每10cm2培養(yǎng)皿TRIzol使用量為1mL），搖勻，充分裂解后吸到經(jīng)DEPC處理過的EP管中，經(jīng)過氯仿的處理后12000 r/min，4℃，離心15min。然后取上清無色水相到EP管（DEPC處理過），加0.5mL新開的異丙醇，室溫下靜置10min后，12000 r/min，4℃，離心10min。觀察總RNA在管底的白色沉淀，棄去上清，75％乙醇1.0mL洗滌（用DEPC水新配制）后，7 500r/min，4℃，離心5min。去上清，用小Tip吸干液體。氣干沉淀5～10min，DEPC處理水20～30μL加入，用槍打勻，55～60℃水浴10min溶解總RNA，保存。②RNA質(zhì)量檢測，使用Nanodrop測定RNA在分光光度計260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。用于檢測的RNA樣品，必須是高質(zhì)量的，完整的，沒有RNase污染。用甲醛電泳試劑進行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。提供RNA QC報告。③應(yīng)用real-time PCR測定LEF1的表達水平，F(xiàn)irst strand cDNA synthesis kit（Amasham Pharmacia）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，Real-time PCR采用SYBR?Green PCR Master Mix（Bio-Rad）進行擴增，IQ5進行熒光定量分析。實驗用引物使用專門軟件Permer Primier 5.0設(shè)計，遵循以下原則，引物與模板的序列緊密互補；物與引物之間避免穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)形成；引物不在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。LEF1（5′-3′）Fw，AAATAAAGTGCCCGTGGTGC；Rv，CATGCCTTGTTTGGAGTTGACA。對照組用GAPDH（5′-3′）Fw，ATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG；Rv，GTGGAGGAGTGGGTGTCGC。按照實驗手冊說明進行液體配置，反應(yīng)條件設(shè)置為，95℃，2min，1循環(huán)；95℃，30s，60s，30s，72℃，1min，共40個循環(huán)；最后72℃，10min延伸。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法：應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 RNA質(zhì)量檢測報告表及瓊脂糖凝膠電泳圖：見表1，圖1。

表1 RNA質(zhì)量及品質(zhì)的檢測報告Table 1 RNA Quantification and Quality Assurance by NanoDrop ND-1000

圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 RNA Integrity and gDNA contamination Test by Denaturing Agarose Gel Electrophoresis

2.2 DAC與PTX單獨作用于2種腎癌細胞株后LEF1表達水平的變化：脫甲基化藥物DAC與PTX單獨作用時，2種腎癌細胞株中LEF1的表達均降低，并且LEF1的表達水平隨藥物濃度的增加而下降，且呈現(xiàn)劑量依賴性。見圖2～5。

圖2 不同劑量DAC對ACHN腎癌細胞株中LEF1 mRNA表達量的影響Figure 2 The role of DAC on LEF1 mRNA in ACHN RCC cell lines（Real-time PCR）

圖3 不同劑量DAC對NC65腎癌細胞株中LEF1 mRNA表達量的影響Figure 3 The role of DAC on LEF1 mRNA in NC65 RCC cell lines（Real-time PCR）

圖4不同劑量PTX對ACHN腎癌細胞株中LEF1 mRNA表達量的影響Figure 4 The role of PTX on LEF1 mRNA in ACHN RCC cell lines（Real-time PCR）

圖5 不同劑量PTX對NC65腎癌細胞株中LEF1 mRNA表達量的影響Figure 5 The role of PTX on LEF1 mRNA in NC65 RCC cell lines（Real-time PCR）

2.3 DAC聯(lián)合PTX處理腎癌細胞株后LEF1表達水平的變化：當(dāng)DAC和PTX 2種藥物聯(lián)合應(yīng)用于腎癌細胞株時，LEF1的表達水平顯著低于DAC或PTX單劑作用效果（P＜0.01）。見圖6～10，表2～4。

圖6 DAC聯(lián)合PTX作用于ACHN腎癌細胞株對LEF1 mRNA表達量的影響Figure6 The role of DAC and PTX on LEF1 mRNA in ACHN RCC cell lines

圖7 DAC與PTX聯(lián)合作用于NC65腎癌細胞株對LEF1 mRNA表達量的影響Figure 7 The role of DAC and PTX on LEF1 mRNA in NC65 RCC cell lines

圖8 DAC對ACHN、NC65 2種腎癌細胞株LEF1 mRNA表達量的分析Figure 8 Effect of DAC on LEF1 mRNA in two kinds of RCC cell lines

圖9 PTX單獨作用于ACHN腎癌細胞株與DAC聯(lián)合PTX作用對LEF1 mRNA表達量的分析Figure 9 Effect of PTX alone or combined DAC and PTX on LEF1 mRNA in ACHN cell line

圖10 PTX單獨作用于NC65腎癌細胞株與DAC聯(lián)合PTX作用對LEF1 mRNA表達量的分析Figure 10 Effect of PTX alone or combined DAC and PTX on LEF1 mRNA in NC65 cell line

表2 DAC作用于ACHN與NC65 2種腎癌細胞株后LEF1 m RNA表達量比較Table 2 Effect of DAC on LEF1 m RNA in two kinds of RCC cell lines

表3 PTX單獨作用于ACHN腎癌細胞株與DAC聯(lián)合PTX作用后LEF1 m RNA表達量比較Table 3 Effect of PTX alone or combined DAC and PTX on LEF1 m RNA in ACHN cell line

表4 PTX單獨作用于NC65腎癌細胞株與DAC聯(lián)合PTX作用后LEF1 m RNA表達量比較Table 4 Effect of PTX alone or com bined DAC and PTX on LEF1 m RNA in NC65 cell line

3 討 論

化療藥物單獨治療RCC的臨床效果不佳，總緩解率只能達到5％左右，其原因可能與位于腎癌細胞膜上的P-糖蛋白和MRP蛋白等介導(dǎo)跨膜轉(zhuǎn)運基因的表達增高和活性增強有關(guān)，導(dǎo)致毒性藥物分子被加速排除到細胞外，細胞內(nèi)藥物蓄積濃度降低不能達到治療濃度。

DAC與DNA結(jié)合，抑制DNMTS（DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶）活性，在細胞分裂時使甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，使新合成的DNA低甲基化，并且隨著細胞分裂次數(shù)的增加，DNA甲基化程度逐漸減低，能夠上調(diào)因高度甲基化而失活基因的表達［2］。已經(jīng)有一些研究開始探討體外實驗中DAC與化學(xué)療法在對抗實體瘤過程中的功效，結(jié)果顯示DAC可以增加化療藥物的作用，同時增強腫瘤細胞對化療的敏感性［3－4］。

PTX屬于有絲分裂抑制劑，紫杉醇的抗癌機制主要是通過結(jié)合到微管蛋白上，促進微管蛋白的聚合，并阻滯其解聚成亞單位，從而凍結(jié)有絲分裂的紡錘體，使細胞停滯于G2/M期，誘導(dǎo)細胞凋亡［5］。另外，Merchan等［6］研究表明紫杉醇除了細胞毒作用外，有較強的抗血管生成作用。

有研究［1］發(fā)現(xiàn)DAC通過細胞周期捕獲抑制腎癌細胞株生長，使腫瘤細胞阻滯于G2/M期。PTX通過細胞周期捕獲和促進細胞凋亡兩方面殺傷腎癌細胞株。當(dāng)DAC與PTX同時作用于癌細胞株時，DAC明顯增加了PTX殺傷腎癌細胞株的作用。

Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在生物發(fā)育、細胞轉(zhuǎn)運、腫瘤形成及細胞凋亡等生命過程中發(fā)揮重要作用，其異?；罨c腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。LEF1是Wnt信號通路中的關(guān)鍵因子，Roose等［7］研究發(fā)現(xiàn)剔除LEF1基因小鼠會發(fā)生胚胎性致死，因此，LEF1被認為在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。目前的研究表明LEF1至少存在2種以上的亞型［8］，在某些腫瘤和癌細胞株中檢測到的LEF1全部是β-catenin依賴性LEF1亞型，即全長型LEF1［9］。它通過和β-catenin結(jié)合持續(xù)激活Wnt信號途徑，繼而激活一系列靶基因來影響細胞增殖和凋亡的調(diào)控，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。最近幾年Wnt信號傳導(dǎo)通路與腎癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系也逐漸得到關(guān)注。

本實驗中我們通過定量PCR方法設(shè)定DAC和PTX在多個濃度梯度下進一步驗證基因芯片數(shù)據(jù)，結(jié)果表明體外脫甲基化藥物DAC或紫杉醇處理腎癌細胞后LEF1的表達降低，并且2種藥物聯(lián)合應(yīng)用時LEF1表達水平顯著低于任一藥物單獨作用。也就說明LEF1在DAC聯(lián)合PTX應(yīng)用抑制腎癌細胞生長的過程中，是一個重要的靶基因。

綜上所述，LEF1作為一個關(guān)鍵基因參與了脫甲基化藥物DAC與紫杉醇在抑制腎癌細胞生長的相乘作用，是否能說明LEF1是一個新的腎癌靶點，尚需進一步研究。

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［9］王淑紅，南克俊，田濤，等.β-catenin依賴性LEF1亞型對宮頸癌HeLa細胞生物行為學(xué)的影響［J］.西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2010，31（3）：313－317.

（本文編輯：趙麗潔）

EFFECTS ANALYSISOF LEF1 IN THE DEMETHYLATION DRUG DAC AND PACLITAXEL IN THE TREATM ENT OF RENAL CELL CARCINOMA

SUN Shiwei1，LIYuan2*，ZHAO Chunli3，SHANG Donghao4
（1.Department of Urology，Petroleum Geophysical Exploration Center Hospital of Hebei University，Hebei Province，Xushui072555，China；2.Department of Cardiology，the Fourth Hospital of Shijiazhuang City，Hebei Province，Shijiazhuang 050011，China；3.Department of Urology，the Affiliated Hospital of Hebei University，Hebei Province，Baoding 071000，China；4.Department of Urology，Beijing Friendship Hospital，Beijing 100050，China）

kidney neoplasms；deoxycytidine；paclitaxel

R737.11

A

1007-3205（2013）04-0391-06

2012－07－24；

2012－10－10

國家自然科學(xué)基金項目（30801139）

孫式偉（1975－），男，河北海興人，河北大學(xué)附屬石油物探中心醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事泌尿外科疾病診治研究。

*通訊作者。E-mail：liyuandoctor9898＠sina.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.04.007

【關(guān)鍵詞】ABSTRACT：ObjectiveTo investigate the synergistic mechanism of 5-Aza-2′-Deoxycytidine（DAC）and paclitaxel（PTX）on Renal cell carcinoma cell lines and to discuss the function of lymphoid enhancer-binding factor 1（LEF1）in this process.M ethodsThe mRNA expression of LEF1 was detected to discuss the function of LEF1 on the synergy effect of DAC and PTX by real time Polymerase Chain Reaction.ACHN and NC65 cell lineswere continuous treated for 72 hourswith DAC：0.5，1，2，4，8μmol/L；PTX：1，2，4，8，16nmol/L.Total RNA was isolated using Rneasy mini kit（Qiagen），the First strand cDNA synthesis kit（Amasham Pharmacia）was used for reverse transcription，quantitative realtime PCR was performed using SYBR?Green PCR Master Mix（Applied Biosystems）and fluorescence quantitative analysis by IQ5.ResultsThemRNA expression of LEF1 was decreased in the processing of combined use of DAC and PTX compared with DAC or PTX alone.Conclusion LEF1 will be animportant target gene in the synergy of DAC and PTX against RCC.