不同佐劑和激發(fā)方式對哮喘小鼠肺部炎性反應(yīng)的影響

鐘文清，譚建新

（廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心，廣東湛江524023）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)主要為喘息、氣急、胸悶或咳嗽等，肺部病理改變一般為炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤和氣道慢性炎性反應(yīng)等。小鼠是最常用于構(gòu)建哮喘模型的動物，國內(nèi)外的學(xué)者所用的佐劑和激發(fā)方式各異。較常用的佐劑為氫氧化鋁和十二水硫酸鋁鉀，激發(fā)方式常用的有霧化和滴鼻。建立穩(wěn)定的哮喘模型是研究哮喘發(fā)病及其治療的基礎(chǔ)。本研究通過比較不同佐劑和激發(fā)方式對哮喘模型的影響，觀察小鼠肺組織中氣管和血管周圍的炎性反應(yīng)，進(jìn)一步觀察在停止霧化10d后肺部炎性反應(yīng)的消退情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 38只無特定病原體（SPF）級小鼠購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，所有小鼠均為6～8周雌性。

1.2 主要試劑和材料 雞卵清蛋白（OVA）、氫氧化鋁，均購自美國Sigma公司；十二水硫酸鋁鉀購自上海阿拉丁公司；KYWH1004型霧化器（霧化顆粒小于5μm）由佛山凱亞醫(yī)療科技有限公司生產(chǎn)；紅細(xì)胞裂解液由北京康為世紀(jì)公司生產(chǎn)；快速瑞氏染液由南京建成科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 致敏液與激發(fā)液配制 致敏液分3種：哮喘組每只小鼠注射200μL致敏液Ⅰ（100μg OVA和2mg十二水硫酸鋁鉀溶于200μL生理鹽水）或致敏液Ⅱ（100μg OVA和2mg氫氧化鋁溶于200μL生理鹽水）；對照組用生理鹽水代替致敏液致敏。激發(fā)液分3種：1%OVA（1g OVA溶于100mL生理鹽水中）、滴鼻液（100μg OVA溶于30μL生理鹽水中）、生理鹽水（對照組用生理鹽水作為激發(fā)液）。

1.3.2 動物分組與激發(fā)方法 采用隨機(jī)數(shù)表法將小鼠隨機(jī)分成A～F 6組，除D組8只外其余每組6只，先取3組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：分別為A組（對照作用，用生理鹽水致敏，生理鹽水霧化7 d）、B組（用致敏液Ⅱ致敏，1%OVA霧化7d）、C組（用致敏液Ⅰ致敏，1%OVA霧化7d）；經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)十二水硫酸鋁鉀作佐劑致敏效果較好（結(jié)果見后），再取3組用致敏液Ⅰ致敏，以激發(fā)方法不同分別分為D組（用滴鼻液激發(fā)3d）、E組（用1%OVA霧化5d）、和F組（用1%OVA霧化7d，在末次霧化10 d后處死）。所有實(shí)驗(yàn)組均于第0、14天腹腔注射致敏，于第21天開始激發(fā)，霧化時(shí)間為每天30min。D組滴鼻激發(fā)前用1%戊巴比妥鈉10mL／kg腹腔注射麻醉，然后將30μL滴鼻液緩慢交替滴入2個(gè)鼻孔。

1.3.3 支氣管肺泡灌洗 于末次激發(fā)24h后（其中F組末次激發(fā)10d后）經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉摘眼球放血處死，仰臥位固定，分離頸部皮膚和肌肉充分暴露氣管，用血管夾夾閉左主支氣管，用注射器經(jīng)環(huán)狀軟骨做氣管插管，0.5mL生理鹽水對右肺進(jìn)行灌洗3次后回收80%左右。肺泡灌洗液（BALF）于4℃500g離心10min，棄上清后用100μL生理鹽水重懸，參照說明書裂解紅細(xì)胞，沉淀再用100μL生理鹽水重懸，用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)白細(xì)胞總數(shù)。重懸液涂片后進(jìn)行瑞氏染色，分類計(jì)數(shù)至少200個(gè)白細(xì)胞。

表1 不同佐劑及激發(fā)方式對BALF白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)（±s，%）

表1 不同佐劑及激發(fā)方式對BALF白細(xì)胞總數(shù)及分類計(jì)數(shù)（±s，%）

a：P＜0.05，與 A組比較；b：P＜0.05，與B組比較；c：P＜0.05，與C組比較；d：P＜0.05，與D組比較。

.26±3.01 B組 71.08±5.89a 40.02±2.75a 38.67±2.95a 8.37±1.93 12.94±2.62a C 組 360.83±30.69ab 46.33±7.01ab 35.27±4.03a 7.16±2.16 11.24±2.75a D 組 13.76±1.58ac 32.47±7.24abc 42.15±8.54ac 18.49±3.44abc 6.89±2.43ab E 組 316.83±28.25ad 45.28±6.89ad 25.15±6.62abcd 16.10±5.62 13.47±3.89 F組 13.71±2.08a 13.66±2.23abcd 51.72±3.36abcd 11.93±4.26 22.69±4.02 E M N L A 組 8.75±1.13 2.50±1.96 70.35±5.41 6.88±2.12 20組別 白細(xì)胞（×103）bcd

圖1 各組肺組織炎性反應(yīng)比較（HE×200）

1.4 肺組織蘇木素-伊紅（HE）染色 左肺用10%甲醛固定24h后經(jīng)脫水和常規(guī)石蠟包埋，切片厚度為3μm，HE染色后鏡下觀察肺部炎性反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，所有數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用ANOVA檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 激發(fā)時(shí)的表現(xiàn) D組在滴鼻的過程中出現(xiàn)明顯腹式呼吸，呼吸加深加快，有1只因?yàn)槁樽磉^深、滴鼻過快而死亡。除A組外，所有霧化激發(fā)哮喘小鼠在第3次霧化時(shí)均出現(xiàn)煩躁不安、抓鼻、大小便失禁。

2.2 BALF細(xì)胞計(jì)數(shù) 各組BALF的白細(xì)胞總數(shù)比較，見表1。C組炎性反應(yīng)較B組嚴(yán)重（P＜0.05）。與A組比較，D組白細(xì)胞輕度增高（P＜0.05），B、C和 E組都顯著增高（P＜0.05）。C、E組與 D組比較，白細(xì)胞明顯增多（P＜0.05）。F組與C組比較，白細(xì)胞顯著下降（P＜0.05）。C組較E組白細(xì)胞多但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.262）。對BALF的白細(xì)胞［包括嗜酸性粒細(xì)胞（E）、單核細(xì)胞（M）、中性粒細(xì)胞（N）和淋巴細(xì)胞（L）］進(jìn)行計(jì)數(shù)和分類計(jì)數(shù)。在各組的嗜酸性粒細(xì)胞比較中：B組較C降低；與A組比較，其余各組均增高；B、C及E組均較D組增高；C組與E組無差別；F組比B、C、D及E組均明顯降低，見表1。

2.3 各組肺組織炎性反應(yīng)比較 氣管和血管周圍炎性反應(yīng)比較，A組氣管完整，氣管周圍未出現(xiàn)炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤的現(xiàn)象，肺部小動靜脈周圍無炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，紋理清晰，見圖1A。B組氣管及血管周圍炎性反應(yīng)較明顯，部分氣管內(nèi)有黏液栓形成，見圖1B。C組氣道周圍炎性反應(yīng)浸潤，氣管上皮細(xì)胞增厚部分脫落，杯狀細(xì)胞增高，部分氣道平滑肌細(xì)胞增厚，氣管內(nèi)有黏液栓形成，血管周圍大量的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，見圖1C，氣管及血管周圍炎性反應(yīng)較B組重。D組局部氣管出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)、黏液栓形成，局部小血管周圍出現(xiàn)大量的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。但仍有大部分氣管及血管周圍無炎性反應(yīng)浸潤；E組肺部炎性反應(yīng)類似于C組。F組觀察到氣管周圍炎性反應(yīng)明顯減輕，基本恢復(fù)正常；血管周圍炎性反應(yīng)細(xì)胞明顯減輕但仍未恢復(fù)正常，仍能觀察到少量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤。

3 討 論

過敏性哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞增高和氣道高反應(yīng)性為特點(diǎn)的氣道炎性反應(yīng)，并伴有多種細(xì)胞因子參與的過程。環(huán)境、種屬、佐劑及激發(fā)方法對小鼠哮喘炎性反應(yīng)均有影響［1］，然而，不同激發(fā)方式對哮喘模型的影響較少報(bào)道［2］。雖然近年研究哮喘特別是難治性哮喘較多采用塵螨作為過敏原［3-5］，但在研究哮喘的防治上更多的是用OVA作為過敏原［6-7］，本研究亦采用OVA作為過敏原，先比較十二水硫酸鋁鉀和氫氧化鋁佐劑對哮喘模型的影響，同樣激發(fā)7d均能成功誘發(fā)哮喘，但無論從BALF中的白細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，還是從肺組織中氣道和血管周圍炎性反應(yīng)比較，以十二水硫酸鋁鉀為佐劑的炎性反應(yīng)程度比氫氧化鋁更嚴(yán)重，這可能與十二水硫酸鋁鉀佐劑的乳化效果更好有關(guān)［1］。

在研究急性哮喘模型中，急慢性模型的構(gòu)建有不同的方法［8-10］。為了更好地觀察肺部炎性反應(yīng)表現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)采用5次和7次的霧化激發(fā)方式進(jìn)行研究，同時(shí)也比較3次滴鼻激發(fā)的效果。對于哮喘組，在觀察其激發(fā)過程的表現(xiàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)有個(gè)別小鼠在第1次霧化時(shí)就出現(xiàn)抓鼻、煩躁不安和大小便失禁，第3次激發(fā)時(shí)普遍出現(xiàn)上述現(xiàn)象，這說明常用的3次霧化激發(fā)能建立較穩(wěn)定的哮喘模型［11-12］，激發(fā)5次和7次后能出現(xiàn)較明顯的炎性反應(yīng)表現(xiàn)，但兩者的炎性反應(yīng)表現(xiàn)無明顯差別，7次霧化組的部分氣道平滑肌細(xì)胞輕度增厚。平滑肌細(xì)胞的增生是氣道重塑的重要組成部分［13-15］，這說明連續(xù)激發(fā)7d后才開始出現(xiàn)氣道重塑的病理改變，這也能解釋為什么研究氣道重塑應(yīng)該選用慢性哮喘模型。滴鼻也能誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生［2，16-17］，雖然滴鼻的操作簡單耗材也較少，但滴鼻激發(fā)受干擾的因素很多，主要與操作者的技術(shù)有關(guān)，麻醉得太深或滴得太快均會導(dǎo)致小鼠死亡，本實(shí)驗(yàn)有1只小鼠因此窒息死亡，觀察發(fā)現(xiàn)在麻醉后接近蘇醒的狀態(tài)下滴鼻效果最好。滴鼻的過程中要不斷翻動小鼠以達(dá)到OVA能均勻地進(jìn)入肺部，但即使這樣也不能均勻地進(jìn)入肺部，肺部病理切片發(fā)現(xiàn)，局部的氣道和血管炎性反應(yīng)嚴(yán)重，但整個(gè)肺部炎性反應(yīng)較輕，這可能與滴注OVA時(shí)局限于個(gè)別氣道有關(guān)。與正常對照組比較，滴鼻組BALF中的嗜酸性粒細(xì)胞雖然明顯增高，但總炎性反應(yīng)細(xì)胞增高并不明顯。與滴鼻比較，霧化組整體炎性反應(yīng)明顯，肺組織病理也能發(fā)現(xiàn)大部分氣道和血管周圍出現(xiàn)較明顯的炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤，這有可能是引起B(yǎng)ALF中炎性反應(yīng)細(xì)胞明顯增高的原因。

綜上所述，建立哮喘模型與佐劑和激發(fā)方式密切相關(guān)。十二水硫酸鋁鉀能溶于水，乳化效果比氫氧化鋁好，是較理想的佐劑。在研究肺部整體炎性反應(yīng)時(shí)，傳統(tǒng)的霧化激發(fā)方法較滴鼻好。采用5次霧化較3次滴鼻激發(fā)的方法能更有效地誘導(dǎo)哮喘的發(fā)生。

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