高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的動力學(xué)

汪少華，余元善，徐玉娟,*，肖更生，吳繼軍，唐道邦，曹清明

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的動力學(xué)

汪少華1,2，余元善1，徐玉娟1,*，肖更生1，吳繼軍1，唐道邦1，曹清明2

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，廣東 廣州 510610；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

研究影響高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的因素，并應(yīng)用兩段模型分析了高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化動力學(xué)。結(jié)果表明：CO2壓力、處理溫度、處理時間和樣品pH值都能顯著影響高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率；高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化過程符合兩段模型；高壓CO2處理能有效的鈍化香蕉果肉多酚氧化酶，提高CO2壓力和處理溫度、延長處理時間和適當(dāng)降低樣品的pH值都能顯著增強高壓CO2處理鈍化酶的速率；20MPa、55℃的高壓CO2處理40min后能鈍化83.5%的香蕉果肉多酚氧化酶，當(dāng)溫度升到60℃，20 MPa的高壓CO2處理時，20min處理后僅殘留有4.2%的多酚氧化酶活力。

高壓CO2；香蕉果肉；多酚氧化酶；鈍化

多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是含有銅離子的氧化酶，根據(jù)催化底物特異性一般包括單酚氧化酶(tyrosinase)和鄰苯二酚氧化酶(catechol oxidase)[1]。廣泛分布在各種植物組織中，能催化植物組織中的多種酚類氧化成褐色的醌類物質(zhì)。在食品加工中，由于植物組織的損壞，使多酚氧化酶能有效的與底物(氧氣和酚類物質(zhì))結(jié)合，導(dǎo)致酶促褐變的發(fā)生，對產(chǎn)品的感官營養(yǎng)特性，特別是消費者接受性帶來不利的影響[2-3]。香蕉屬于熱帶/亞熱帶氣候地區(qū)種植的主要經(jīng)濟作物，在我國廣東、廣西和海南等省也有大面積種植[4-5]。香蕉果肉中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)不僅可以鮮食，還可以加工成其他多種產(chǎn)品，如香蕉淀粉(抗性淀粉)、香蕉粉(嬰幼兒奶粉添加劑)、香蕉脆片(休閑食品)、香蕉汁、香蕉酒和香蕉醋等。香蕉果肉和果皮中含有豐富的多酚氧化酶和酚類物質(zhì)，在食品加工中，特別是前處理階段，怎樣防止香蕉產(chǎn)品酶促褐變是一個非常棘手的問題。為了抑制褐變，傳統(tǒng)的方法是通過熱加工或一些化學(xué)護色劑(檸檬酸、亞硫酸鹽和抗壞血酸等)來鈍化或抑制香蕉果肉多酚氧化酶活力。熱加工易使產(chǎn)品產(chǎn)生蒸煮味，并對香蕉中的營養(yǎng)成分破壞較大，而護色工藝本身不能完全鈍化香蕉多酚氧化酶，且護色劑的添加容易產(chǎn)生一系列的食品安全問題，對產(chǎn)品的風(fēng)味也有一定的影響[5-6]。因此，尋找新的加工方法來鈍化香蕉果肉多酚氧化酶，并減少對其營養(yǎng)成分的破壞，是提高香蕉加工產(chǎn)品品質(zhì)，實現(xiàn)高附加值的有效途徑。

高壓CO2技術(shù)是目前發(fā)展較快的一種新型的非熱加工技術(shù)，它克服了熱加工造成的種種弊端[7-8]。研究表明，在一定的壓力下(3～30MPa)，CO2對食品中微生物具有殺滅效果，同時能使部分酶鈍化。目前，關(guān)于高壓CO2技術(shù)對食品中微生物的滅菌效果研究較多，但對食品內(nèi)源酶鈍化作用的研究相對較少。幾項研究表明，高壓CO2技術(shù)處理能有效降低多種酶的活性，并認為酶活性的降低與酶二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)變化有關(guān)[9-11]。Ishkawa等[12]發(fā)現(xiàn)，在25MPa、35℃、30min的超臨界CO2的處理下，脂肪酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶以及葡萄糖氧化酶的活性分別為處理前的62.9%、31.3%、37.6%、12.4%，同時觀察到處理后α-螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，可能是這種變化導(dǎo)致了酶活性的變化。

酶鈍化動力學(xué)模型是根據(jù)鈍化隨時間變化效果的數(shù)學(xué)描述，來反應(yīng)酶的穩(wěn)定性和多樣性以及自身對處理條件的敏感性。根據(jù)對酶鈍化的研究文獻看，一般有一級動力學(xué)模型、部分轉(zhuǎn)化模型和兩段式模型[13-15]。不同種類和來源的酶鈍化過程差異較大。目前，高壓CO2對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化動力學(xué)仍未見報道。

本實驗研究影響高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的因素，并且分析了高壓CO2對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化動力學(xué)，旨在為高壓CO2技術(shù)在香蕉加工中的酶促褐變控制提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

香蕉 屬于廣州本地蕉品種(七八成熟，黃綠色)，購自廣州當(dāng)?shù)爻小?/p>

99.5 %二氧化碳氣體 廣州龍奧氣體設(shè)備有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

處理設(shè)備流程圖Fig.1 Flow chart of high pressure carbon dioxide processing equipment圖1 高壓CO2

打漿機 美的集團公司；高速分散均質(zhì)機 上海標(biāo)本模型廠；紫外-可見分光光度計 日本島津公司；高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；高壓CO2處理設(shè)備(圖1是該設(shè)備流程圖) 杭州華磊泵業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 香蕉果肉多酚氧化酶液的制備

將購買的香蕉去皮，將果肉切成1cm長的小段；100g果肉與250mL的0.1mol/l磷酸鈉鹽緩沖液體(pH 5.5)混合，同時添加3.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)和3.5mL Triton X-100；放置在打漿機中中速處理3min后，轉(zhuǎn)入500mL燒杯中高速均質(zhì)5min；將上述均質(zhì)后的樣品于4℃條件下10000×g離心10min，上清液即是香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液(pH5.45)。

另外，使用2mol/L的鹽酸或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)上述香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液，獲得不同pH值的粗酶液(pH值在3.5～7.5之間)，以供樣品的pH值對高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的影響研究。

1.2.2 樣品高壓CO2處理方法

取200mL香蕉果肉多酚氧化酶的粗酶液置于高壓CO2裝置的樣品釜中，調(diào)節(jié)樣品釜的溫度和CO2的壓力到設(shè)定值(2～3min)，恒溫恒壓保持設(shè)定的時間后，緩慢釋放CO2到正常大氣壓(3～4min)，取出樣品并立即將其置于冰浴中短暫貯藏，用于分析樣品中殘留的多酚氧化酶活力。以不充CO2的樣品處理為正常大氣壓對照，結(jié)果以相對殘留酶活力表示。

1.2.3 多酚氧化酶活力測定方法

多酚氧化酶活力測定采用鄰苯二酚法[16]。具體為：0.5mL 50mmol/L鄰苯二酚水溶液、 2mL 50mmol/L的磷酸鈉鹽緩沖液(pH 7.0)和20μL待測樣品酶液充分混合，反應(yīng)體系溫度為30℃，立即置于分光光度計中，測定并監(jiān)控OD420nm值的變化，以每分鐘ΔOD420nm變化0.001所需的酶量為一個酶活力單位(U)。

1.2.4 酶失活動力學(xué)模型和數(shù)據(jù)公式

一級動力學(xué)模型常用于酶失活動力學(xué)分析，酶失活率與處理時間成正比(式2)。

式中：A0為處理前酶活力/U；A為處理后酶活力/U；t為處理時間/min；k為給定溫度和CO2壓力下的失活速率/min-1。

如果發(fā)現(xiàn)結(jié)果不符合一級動力學(xué)模型時，可采用兩段模型，該模型包含了快速鈍化期和緩慢鈍化期兩段(式3)，一般有同工酶存在時使用此模型。

式中：AL和As分別為快速鈍化期和緩慢鈍化期的初始酶活力/U；kL和kS分別為分別為快速鈍化期和緩慢鈍化期的反應(yīng)速率常數(shù)/min-1；A為處理后酶活力/U；t為處理時間/min。

在酶鈍化失活過程中，當(dāng)只有敏感性部分被鈍化，而穩(wěn)定性部分酶活保持不變時，一般采用部分轉(zhuǎn)化模型(式4)。

式中：A為處理后酶活力/U；t為處理時間/min；A0和A∞為處理前酶活力和不變酶活力/U；k為反應(yīng)速率常數(shù)/min-1。

其他相關(guān)公式有：

式中：D值指給定條件下，酶活力達到90%失活所需要的時間/min；ZP和ZT表示D值對壓強(MPa)和溫度(℃)的敏感性，指D值減少90%時對應(yīng)的壓力和溫度的各自需要的增加量；P1和P2表示D1和D2對應(yīng)的壓強/MPa；T1和T2表示D1和D2對應(yīng)的溫度/℃。

溫度對酶鈍化反應(yīng)的影響用Arrhenius公式分析?；罨蹺a(kJ/mol)表示溫度對反應(yīng)常數(shù)k的影響；T2和T1表示對應(yīng)k1和k2的絕對溫度/K；R是氣體常數(shù)(8.314J/kmol)。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常大氣壓下溫度對香蕉果肉多酚氧化酶鈍化動力學(xué)的影響

表1 香蕉果肉多酚氧化酶粗酶液經(jīng)常壓溫?zé)崽幚砗蟮南鄬埩裘富盍able1 Relative residual activity of crude PPO from banana pulp after mild thermal treatment under atmospheric conditions %

在溫?zé)崽幚硐?正常大氣壓，溫度為30～60℃)，隨著處理溫度和時間的延長，香蕉果肉多酚氧化酶的酶活力有明顯的減少(P＜0.05)。此外，結(jié)果也表明香蕉果肉多酚氧化酶具有較強的耐熱性，香蕉果肉粗酶液(pH5.45)在60℃處理80min后，仍殘留有83.1%的酶活力(表1)。大部分酶的熱失活符合一級動力學(xué)模型，將表1中的數(shù)據(jù)帶入公式(2)和公式(5)～(7)，分別估算出香蕉果肉多酚氧化酶在常壓30、40、50、55、60℃處理下的D值分別為1976.6、1730.4、 1270.4、 1036.9 、995.2min，并且也可以推算出其ZT值為100.7℃(R2=0.974)。

2.2 高壓CO2處理壓力對香蕉果肉多酚氧化酶鈍化動力學(xué)的影響

圖2 香蕉果肉多酚氧化酶在55℃經(jīng)高壓CO2處理后的相對殘留酶活力Fig.2 Relative residual activity of crude PPO from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide at 55 ℃

由圖2可以看出，香蕉果肉多酚氧化酶55℃高壓CO2處理的失活特性明顯不同于常壓55℃處理，高壓CO2處理能顯著提高香蕉果肉多酚氧化酶的失活率，并且一級失活模型不能很好的表征香蕉多酚氧化酶在高壓CO2處理下的失活特性。香蕉果肉多酚氧化酶在高壓CO2處理下呈現(xiàn)快速鈍化期和緩慢鈍化期兩個階段，它們適合用兩段模型來表征。

表2 香蕉果肉多酚氧化酶在55 ℃、高壓CO2處理條件下的鈍化動力學(xué)參數(shù)(兩段模型估算)Table2 Kinetic parameters for PPO from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide at 55 ℃(estimated by two-fraction model)

從表2可知，在15MPa以下時，隨著CO2壓力的提高，香蕉果肉多酚氧化酶在快速鈍化期的失活率也顯著的快速提高，而在15MPa以上時，CO2壓力的提高對香蕉果肉多酚氧化酶的失活速率影響不顯著(P＞0.05)。很多研究認為，高壓CO2的鈍酶機制與超高壓的鈍酶機制是完全不一樣的。超高壓鈍化酶是通過高靜力壓(100MPa以上)的作用來誘導(dǎo)酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而失活，隨著壓力的增加，酶的失活速率明顯增大，而在高壓CO2處理鈍酶過程中，壓力一般較低(低于50MPa)，單獨的壓力作用不能夠?qū)е旅傅氖Щ頪14-17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，在15MPa以上時，CO2壓力的提高對香蕉果肉多酚氧化酶的失活速率影響不顯著，這說明壓力不是導(dǎo)致高壓CO2失活的主要原因。Meyssami 等[17]認為，在高壓CO2鈍酶過程，溶解于樣品中CO2與水結(jié)合形成碳酸，使樣品溶液的pH值降低才是導(dǎo)致酶失活的主要原因；在高壓CO2處理中，當(dāng)處理條件達到CO2的超臨界點后，壓強的增加不會導(dǎo)致超臨界CO2的密度明顯增加，也就不會導(dǎo)致體系pH值的繼續(xù)降低，從而也就不會影響滅酶效率。

2.3 高壓CO2處理溫度對香蕉果肉多酚氧化酶鈍化動力學(xué)的影響

(20MPa)處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的影響Fig.3 Effect of temperature on inactivation of PPO from banana pulp treated by high pressure carbon dioxide at 20 MPa圖3 溫度對高壓CO2

圖3 是20MPa條件下，不同溫度對高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效果。與常壓條件下同等溫度鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的結(jié)果相比(表1)，高壓CO2處理明顯增強了多酚氧化酶的鈍化效果。不同溫度條件下，高壓CO2(20MPa)處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化動力學(xué)明顯適合用部分轉(zhuǎn)換模型來表征。溫度的提高能顯著增加高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化效果，在60℃條件下高壓CO2處理多香蕉多酚氧化酶快速鈍酶期的酶失活率是30℃條件下的140倍。另外，50℃是高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點，當(dāng)溫度低于50℃時，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率一般，但當(dāng)溫度高于50℃后，高壓CO2鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的效率顯著提高。例如，20MPa、55℃的高壓CO2處理40min后能鈍化83.5%的香蕉果肉多酚氧化酶，當(dāng)溫度升到60℃，20MPa的高壓CO2處理時，20min處理后僅殘留有4.2%的多酚氧化酶活力。

此外，使用兩段模型估算出了不同溫度處理下高壓CO2(20MPa)處理香蕉果肉多酚氧化酶快速鈍化期的D和ZT值。從圖4可知，隨著溫度的升高，D值的常用對數(shù)呈線性下降(R2=0.984)，估算出高壓CO2(20MPa)處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶在快速鈍化期的ZT值為14.78℃。ZT值是表征酶對溫度鈍化敏感性的指標(biāo)，ZT值越大，說明該酶對溫度的耐受性越大。常壓處理下，香蕉果肉多酚氧化酶鈍化的ZT值為100.7℃，這也僅一步證明高壓CO2處理能顯著提高香蕉果肉多酚氧化酶的熱敏感性。

(20MPa)處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶在快速鈍化期的ZTFig.4 ZTfor PPO from banana pulp treated by high pressure carbon dioxide at 20 MPa during quick inactivation圖4 高壓CO2

2.4 樣品pH值對高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的影響

表3 不同pH值的香蕉果肉經(jīng)高壓CO2(20MPa，50℃)處理后的多酚氧化酶相對殘留酶活力Table3 Relative residual activity (%) of PPO sample with different pH from banana pulp exposed to high pressure carbon dioxide (20 MPa, 50℃) %

從表3可知，樣品的pH值能顯著影響高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化效果。20MPa，50℃的高壓CO2處理30min后，pH3.5的樣品中僅殘留有8.4%的酶活力，而pH7.5的樣品中多酚氧化酶的活力幾乎沒有變化。目前，對于實時動態(tài)監(jiān)控高壓CO2處理過程中樣品pH值變化設(shè)備仍然缺乏，我們僅僅測量了樣品在高壓CO2處理前和處理后的pH值(釋放到正常大氣壓后立即測定其pH值)。高壓CO2處理后樣品的pH值都有下降。

研究發(fā)現(xiàn)，在常壓溫?zé)崽幚碇?，pH值較低的果汁樣品中多酚氧化酶的熱敏感性明顯高于pH值較高的果汁樣品[18-19]。在高壓CO2處理中，溶解于樣品中CO2與水結(jié)合形成碳酸，從而使樣品溶液的pH值降低，很多研究認為這可能是導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)改變和失活的原因之一[16-17,20]。結(jié)果表明，在高壓CO2處理鈍化香蕉果肉多酚氧化酶的過程中，低pH值樣品中多酚氧化酶的鈍化效率明顯高于中性pH值樣品，這可能用上述機制來解釋。

3 結(jié) 論

高壓CO2處理能有效的鈍化香蕉果肉多酚氧化酶，且高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化過程符合兩段模型。提高處理溫度和延長處理時間能顯著提高香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化速率；在達到CO2超臨界點前，高壓CO2壓力的增加能顯著提高酶的鈍化速率，而當(dāng)達到二氧化碳超臨界點前后，CO2壓力的繼續(xù)增加將不能明顯提高酶的鈍化效率。

樣品的pH值能顯著影響高壓CO2處理對香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化效果。酸性樣品中香蕉果肉多酚氧化酶的鈍化效率明顯高于中性樣品中酶的鈍化效率。20MPa，50℃的高壓CO2處理30min后，pH3.5的樣品相對殘留酶活力僅有8.4%，而pH7.5的樣品中多酚氧化酶的活力幾乎沒有變化。

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Inactivation Kinetics of Polyphenol Oxidase from Banana Pulp by High-Pressure Carbon Dioxide

WANG Shao-hua1,2，YU Yuan-shan1，XU Yu-juan1,*，XIAO Geng-sheng1，WU Ji-jun1，TANG Dao-bang1，CAO Qing-ming2
(1. Sericulture and Agri-food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China；2. College of Food Science and Engineering, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China)

In this paper, effect of high-pressure carbon dioxide on inactivation of polyphenol oxidase (PPO) from banana pulp was studied, and inactivation kinetics of PPO was analyzed by using a two-fraction model. Results showed that the inactivation of PPO by high-pressure carbon dioxide could be significantly affected by the pressure of carbon dioxide, processing temperature, processing time and sample pH. The inactivation kinetics of PPO was adequately described by using a two-fraction model. High pressure carbon dioxide treatment was an effectively way to inactivate PPO from banana pulp, and the inactivation rate of PPO could be significantly increased by improving carbon dioxide pressure and treatment time, and decreasing sample pH. The reduced residual activity of PPO exposed to high-pressure carbon dioxide (20 MPa, 55 ℃) was 83.5% for 40 min, and only 4.2% of enzyme activity was remained when treated with high-pressure carbon dioxide (20 MPa, 60 ℃) for 20 min.

high-pressure carbon dioxide；banana pulp；polyphenol oxidase；inactivation

TS255

A

1002-6630(2013)03-0217-05

2011-12-11

廣東省自然科學(xué)基金項目(S2011020001226)；廣東省農(nóng)業(yè)科技項目(LNSG2010-14)

汪少華(1986—)，男，碩士研究生，研究方向為食品加工。E-mail：wsh_517@163.com

*通信作者：徐玉娟(1974—)，女，研究員，碩士，研究方向為果蔬加工與保鮮。E-mail：xyj6510@126.com