雙酶法制備花生抗氧化肽

熊 柳，趙云霞，孫慶杰*

(青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109)

雙酶法制備花生抗氧化肽

熊 柳，趙云霞，孫慶杰*

(青島農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 青島 266109)

研究堿性蛋白酶(Alcalase)和風味蛋白酶(Flavourzyme)分步水解花生粕制備花生抗氧化活性肽的工藝條件。結果表明：Alcalase的添加量為0.048AU/g pro，其最佳的底物質量分數(shù)為4%，pH值為8.0、酶解時間180min、酶解溫度60℃。然后向Alcalase水解液中添加Flavourzyme，添加量為15LAPU/g pro，pH值為7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min。在此條件下，花生抗氧化肽得率為90.28%，體系水解度達33.73%，所得花生肽分子質量在5000D以下的為96.92%，具有顯著的抗氧化活性。

花生；水解；活性肽；堿性蛋白酶；風味蛋白酶；正交試驗

花生俗稱香果、地果、落花生，為豆科植物花生種子，主要生長在熱帶和亞熱帶以及地中海沿岸[1]。是世界上六大油料作物之一，約占世界植物油料年產量的14%，種植面積僅次于油菜，居油料作物第二位?；ㄉ蚱湎愦辔睹?，營養(yǎng)豐富，具有補虛、益壽、抗衰老、美容的功能因而被人們譽為“長生果”[2]。在國外，花生的營養(yǎng)保健價值備受人們的青睞，被譽為“植物肉”和“綠色牛乳”。我國花生生產分布范圍非常廣泛，主要集中在山東、河南、河北、安徽等省份，占全國花生產量的60%以上。每年，我國花生產量為1000萬t左右，位居世界第1位，約占全球花生總產量的38%[3]。花生粕是花生仁經壓榨煉油后的副產品，花生榨油后的花生粕中含蛋白質44%以上，這一寶貴的蛋白質大部分作動物飼料利用。國內外研究表明[4-5]，花生蛋白質經過酶解后得到的肽類具有特殊的生理功能，如抗高血壓、抗氧化作用、改善元素吸收和礦物質運輸、激素作用、免疫調節(jié)、抗血栓、降膽固醇、抑制細菌、病毒和抗癌作用、促進生長等。

短肽的制備通常采用蛋白質酶解法[6]。陳麗花等[7]以大豆粕中蛋白為底物，利用堿性蛋白酶水解制備大豆抗氧化肽，得出最佳水解條件為：底物質量分數(shù)5%、酶底比0.7%、pH8.5、溫度50℃、酶解時間4h。Meng Xianju等[8]利用堿性蛋白酶水解制備大豆活性肽，研究表明大豆活性肽能夠清除體內自由基，能夠保護紅細胞細胞膜，并阻止由于脂肪過氧化反應造成的細胞膜的損壞。Gao Dandan等[9]采用中性蛋白酶制取棉籽抗氧化肽，溫度為50℃、pH7.5、酶添加量為6000U/g條件下水解4h，在此條件下，水解度為24.84%。Zhang Junhui等[10]研究了堿性蛋白酶、糜蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風味酶水解大米胚乳蛋白制備抗氧化肽，結果表明中性蛋白酶為最佳的水解酶。目前關于花生肽研究較少，王建化等[11]采用Alcalase及Neutrase蛋白酶酶解花生粕中的蛋白，制取花生抗氧化活性肽。在相同條件下，通過測定水解度得出Alcalase的水解效果比Neutrase好。李瑞等[12]比較了Alcalase酶、N120P及復合蛋白酶對花生粕中蛋白質的酶解效果，證明復合蛋白酶效果最好，確定復合蛋白酶的最佳條件：酶用量1800U/g、酶解時間90min、酶解溫度55℃、pH 6.0、料液比1:9(m/m)。

前期實驗只確定了Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復合對花生粕水解制備花生抗氧化肽的效果最好，本實驗對Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復合水解花生粕制取花生抗氧化肽的工藝條件的優(yōu)化等進行研究，得到雙酶法制取花生抗氧化肽的最優(yōu)工藝參數(shù)，為進一步研究花生抗氧化肽提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

低溫花生粕 青島長壽食品有限公司。

Alcalase堿性蛋白酶(2.4AU/g)、Flavourzyme (500LAPU/g) 丹麥諾維信(中國)投資有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

精密酸度計 上海理達儀器廠；LXJ-IIB型離心機上海安亭科學儀器廠；膜分離設備 北京膜分離技術科技儀器公司；752型紫外分光光度計 北京光譜儀器有限公司；RW20.n型懸臂式攪拌機 廣州儀科實驗室技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 花生活性肽的制備

花生粕粉碎后過60目篩，稱取一定量的花生粕粉加入適量的水配成10%的花生粕懸浮液，經勻漿機勻漿，加入Na2SO3煮沸，冷卻后加入蛋白酶，在一定的條件下水解一段時間后升高溫度進行滅酶處理，然后3000r/min離心分離10min，即得到花生蛋白水解液，40℃干燥即得花生活性肽。

1.3.2 花生活性肽水解度的測定

參照文獻[13]采用pH-stat法。

式中：DH為水解度/%；V為堿液體積/mL；cb為堿液的濃度/(mol/L)；α為α-氨基的解離度；mP為底物中蛋白質總量/g；htot為底物中蛋白質中肽鍵總數(shù)/(mmol/g)，對花生蛋白而言，htot=7.13mmol/g(根據花生蛋白的氨基酸組成計算得到)。

1.3.3 短肽得率測定

短肽得率采用三氯乙酸-可溶性氮(TCA-NSI)法測定[14]。計算公式如下：

式中：m1為在10g/100mL TCA中可溶性氮質量/mg；m2為原料中總氮質量/mg。

1.3.4 花生活性肽的分離

將待超濾的花生蛋白肽溶液配成10mg/mL的溶液，倒入裝液筒中。超濾所用膜選用分子質量為5000D的膜[15]，超濾的操作壓力為，料液比5%～7.5%，操作溫度40℃。超濾完畢后，將濾液進行冷凍干燥，然后稱質量，得分子質量≤5000D的花生活性肽含量。

1.3.5 花生活性肽抗氧化活性的測定

1.3.5.1 加速貯藏實驗

為了快速得出實驗結果，對照組對大豆油進行了60℃條件下加速貯藏實驗，據貨架壽命系數(shù)可計算出60℃條件下保藏2d相當于20℃條件下保藏1個月。

1.3.5.2 抗氧化活性的測定

根據GB/T 5538—1995《油脂過氧化值測定》的方法。采用Schaal烘箱法，取100mL大豆油放入250mL燒杯中，添加油質量0.10%的抗氧化肽，放置60℃鼓風烘箱強化保存，每天取樣，用碘量滴定法測定油樣的過氧化值(POV)，觀察油樣的抗氧化變化趨勢。以空白為對照評價幾種分子質量的抗氧化肽對大豆油的抗氧化效果。

2 結果與分析

2.1 Alcalase和Flavourzyme蛋白酶復合水解最佳工藝條件的確定

2.1.1 Alcalase水解最佳工藝條件的確定

圖1 底物質量分數(shù)對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.1 Effect of substrate concentration on peanut meal hydrolysis by alcalase

在酶種確定的情況下，影響蛋白質的DH的因素有底物濃度、酶解溫度、pH值、酶解時間等[16]。以底物質量分數(shù)4%、pH8.0、酶解溫度55℃、酶解時間180min、加酶量0.048AU/g pro為參考條件，改變任意因素變化梯度，底物質量分數(shù)為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，酶解溫度45、50、55、60、65、70℃，酶解時間為60、90、120、150、180、210、240min，加酶量0、0.02、0.04、0.06、0.08AU/g pro進行單因素試驗，對Alcalase水解花生粕中的蛋白制備花生抗氧化活性肽的工藝條件的確定，結果如圖1所示。在底物質量分數(shù)1%～10%范圍內，花生蛋白-Alcalase體系存在明顯的底物抑制現(xiàn)象，即隨著底物質量分數(shù)的增加DH下降。當?shù)孜镔|量分數(shù)為4%時，DH為16.95%，比底物質量分數(shù)2%時低0.35%，比底物質量分數(shù)6%時高1.75%，可見底物質量分數(shù)從4%增加至6%時，DH下降幅度較大。從理論上來說，體系底物質量分數(shù)過大會造成體系中的有效水分的質量分數(shù)過低，因此就降低了底物和蛋白酶的擴散和運動，從而對水解產生抑制作用；當?shù)孜镔|量分數(shù)過低時，會降低蛋白酶和作用底物的碰撞機率，使水解反應受到抑制[17]。從實驗結果看1%的底物質量分數(shù)盡管降低了底物的質量分數(shù)，但體系的有效水分濃度更高，底物與蛋白酶的運動更加激烈，因此綜合考慮1%的底物質量分數(shù)并未降低蛋白酶與底物的碰撞幾率。即在1%～10%的取值范圍內，只體現(xiàn)出了高質量分數(shù)對水解反應的抑制，并未表現(xiàn)出低質量分數(shù)對水解反應的抑制。在實際生產中原料蛋白濃度過低造成產品絕對產量低，在處理量一定的條件下，必須通過反復生產來增大產品產量，這就使生產過程中能耗增加、設備利用率降低，因而底物質量分數(shù)過低沒有實際意義。最終實驗選擇底物最佳質量分數(shù)為4%。

pH值對酶促反應的影響最有意義的便是它能后影響酶分子上一些氨基酸側鏈的解離狀態(tài)，特別是酶催化活性所需的側鏈基團的解離狀態(tài)，從而影響酶的活性[18]。對于一種酶，它通常有適宜的pH值范圍。由圖2可見，隨著pH值的升高，體系水解度迅速增大，當體系pH值達到8.0時，水解度為16.25%；當體系pH值超過8.0時，水解度呈現(xiàn)下降趨勢。可見Alcalase更適合于偏堿性的環(huán)境，因此Alcalase水解花生粕的最適pH值為8.0，這與孟凡莉[19]研究結果相同。

圖2 pH值對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.2 Effect of pH on peanut meal hydrolysis by Alcalase

由于蛋白酶分子的肽鍵具有特定的空間結構，酶解溫度與蛋白酶分子的穩(wěn)定性緊密相關，若反應溫度過低，體系內分子運動的激烈程度則會大幅降低，致使蛋白酶與底物的碰撞幾率下降；而當反應溫度超過一定限度時，次級鍵便極易解離，從而使得蛋白酶喪失部分或全部催化活性[20]。從圖3可以看出，當溫度在45～55℃范圍時，體系水解度逐漸上升，其中45～50℃時上升迅速，50～55℃時上升緩慢；溫度超過55℃后，體系水解度開始呈下降趨勢，超過60℃后則開始迅速下降。因此Alcalase水解花生粕的最佳作用溫度為55℃，這與陳貴堂等[21]得出的研究結論是一樣的。

圖4 酶解時間對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on peanut meal hydrolysis by Alcalase

Alcalase水解花生粕符合一般的酶解曲線。由圖4可知，經Alcalase酶解不同時間，花生蛋白的水解度隨酶解時間延長而增加，酶作用超過180min以后，水解度的增加趨勢減緩。前期180min內，水解度變化最快，主要是因為酶活力高，產物的抑制作用??；隨著酶解時間的延長，酶活力逐漸下降，產物的抑制作用增加，此階段水解蛋白的量雖然增加較快，但水解度增加緩慢。因此Alcalase水解花生粕的時間為180min。

圖5 加酶量對Alcalase 水解花生粕的影響Fig.5 Effect of Alcalase concentration on peanut meal hydrolysis by alcalase

由圖5可以看出，隨著Alcalase加酶量的增加，水解效果呈增加的趨勢，當加酶量超過0.048AU/g pro時，隨著加酶量的增加，DH的上升趨勢趨于平緩，因此Alcalase的添加量定為0.048AU/g pro。

通過單因素試驗得出，Alcalase水解花生粕蛋白的最佳條件為：花生粕質量分數(shù)4%、pH8.0、酶解溫度55℃、酶解時間180min、加酶量0.048 AU/g pro。

為了優(yōu)化花生粕蛋白的工藝參數(shù)，在單因素試驗的基礎上，進行正交試驗，其試驗因素水平表如表1所示。

表1 Alcalase正交試驗設計與結果Table 1Design and results of orthogonal tests for optimizing the hydrolysis of peanut meal by Alcalase

由表1可以看出，影響花生粕蛋白水解程度的4個因素中D＞A＞B＞C，最佳水解條件為D2A3B2C2，即酶解時間為180min、酶解溫度為60℃、加酶量為0.048AU/g pro、底物質量分數(shù)為4%。

由于實驗組合中未出現(xiàn)理論組合D2A3B2C2，所以進行驗證實驗：向底物質量分數(shù)4%的花生粕料液中添加0.048AU/g pro的Alcalase，調pH值至8.0，在60℃條件下水解180min，此時體系水解度為18.32%。

2.1.2 Flavourzyme水解最佳工藝條件的確定

對Flavourzyme水解花生粕中的蛋白制備花生抗氧化活性肽的工藝條件的確定。因為Flavourzyme最適pH值為5.0～7.0，以pH7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min、加酶量15LAPU/g pro為參考條件，改變任意因素設計梯度，pH值為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，酶解溫度為40、45、50、55、60℃，酶解時間為60、90、120、150、180、210、240min，加酶量為0、5、10、15、20、25LAPU/g pro進行單因素試驗。由圖6a可知，隨著pH值的增大，水解度逐漸升高，當pH值大于7.0時，水解度開始下降，并且Flavourzyme最適pH值為5.0～7.0，因此選擇pH為7.0。由圖6b可知，隨著酶解溫度的升高，水解度逐漸升高，當酶解溫度高于50℃時，水解度開始下降，因此選擇酶解溫度為50℃。由圖6c可知，隨著酶解時間的延長，水解度逐漸升高，當酶解時間高于180min時，水解度上升比較緩慢，因此選擇酶解時間為180min。由圖6d可知，隨著Flavourzyme加酶量的增加水解效果呈增加的趨勢，當加酶量超過15LAPU/g pro，隨著加酶量的增加，DH的上升趨勢趨于平緩，因此Flavourzyme的添加量定為15LAPU/g pro。

圖6 pH值(a)、酶解溫度(b)、酶解時間(c)、加酶量(d)對Flavourzyme(c), Flavourzyme concentration水解花生粕的影響Fig6 Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), hydrolysis time (d) on peanut meal hydrolysis by Flavourzyme

通過單因素試驗得出，F(xiàn)lavourzyme水解花生粕蛋白的最佳條件為：pH7.0、酶解溫度50℃、酶解時間180min、加酶量15LAPU/g pro。

表2 Flavourzyme正交試驗設計與結果Table2 Design and results of orthogonal tests for optimizing the hydrolysis of peanut meal by Flavourzyme

由表2可知，影響花生粕蛋白水解程度的3個因素中B＞A＞C，最佳水解條件為B2A2C2，即酶解時間為180min、酶解溫度為50℃、加酶量為15LAPU/g pro。

對最佳水解條件進行驗證實驗，向Alcalase水解液中添加15LAPU/g pro的Flavourzyme，調pH值至7.0，在50℃條件下水解180min，此時花生活性肽的得率為90.28%，體系水解度為33.73%。

2.2 花生活性肽分子質量的初步測定結果

通過計算，分子質量≤5000D的花生活性肽含量為96.92%，說明花生活性肽的分子質量96.92%分布在5000D以下。

2.3 花生活性肽抗氧化活性的測定結果

表3 花生活性肽對大豆油POV的影響Table3 Effect of peanut antioxidant peptides on POV of soybean oil meq/kg

由表3可知，添加0.10%的花生活性肽到大豆油中，加速貯藏存放36d后，POV為9.93meq/kg，比對照大豆油POV減少78.88%，表明該花生活性肽具有良好的抗氧化活性。

3 結 論

3.1 雙酶法(Alcalase和Flavourzyme蛋白酶)水解低溫花生粕的最佳工藝條件為：向4%的低溫花生粕溶液中添加Alcalase蛋白酶(添加量為0.048AU/g pro)，在60℃條件下

水解180min，然后向Alcalase水解液中添加Flavourzyme蛋白酶(添加量為15LAPU/g pro)，在50℃條件下水解180min，此時花生抗氧化肽的得率為90.28%，體系水解度為33.73%。制得的花生抗氧化肽分子質量96.92%分布在5000D以下。

3.2 雙酶法制取的花生活性肽具有明顯的抗氧化活性，其狀態(tài)是顆粒粉末，與大豆肽相比無苦味。

[1] 張敏. 花生制油工藝的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢[J]. 農機化研究, 2002(4): 19-21.

[2] 張建成, 寧維光. 花生的藥用及保健功能[J]. 中國食物與營養(yǎng), 2005(9): 68-69.

[3] 柳杰. 花生肽抗氧化鈦研究[D]. 無錫: 江南大學, 2010.

[4] DAKAPPAGARI N K, DOUGLAS D B, TRIOZZ P L, et al. Prevention of mammary tumors with a chimeric HER-2B-cell epitope peptide vaccine[J]. Cancer Res, 2000, 60(14): 3782-3789.

[5] DINAKAR P, ARVN K. Enhancing the functionality of food proteins enzyomtic modification[J]. Trends in Food Science and Technology, 1996, 7(4): 120-125.

[6] 張宇昊, 王強. 功能性短肽的研究進展[J]. 中國油脂, 2007(32): 69-73. [7] 陳麗花, 王躍, 朱錦爵. 大豆蛋白抗氧化活性肽的制備工藝研究[J].食品工業(yè), 2011(3): 31-34.

[8] MENG Xianju, ZHANG Xuezhong, WANG Huaiyu. Preparation and antioxidative effects of soybean peptides[J]. Chemical Research in Chinese Universities, 1999, 15(2): 140-145.

[9] GAO Dandan, CAO Yusheng, LI Haixing. Antioxidant activity of peptide fractions derived from cottonseed protein hydrolysate[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2010, 90: 1855-1860.

[10] ZHANG Junhui, ZHANG Hui, WANG Li, et al. Isolation and identification of antioxidative peptides from rice endosperm protein enzymatic hydrolysate by consecutive chromatography and MALDITOF/TOF MS/MS[J]. Food Chemistry, 2010, 119: 226-234.

[11] 王建化, 熊柳, 孫高飛, 等. 花生抗氧化活性肽制取工藝的研究[J].中國油脂, 2008, 33(6): 15-18.

[12] 李瑞, 王旭, 胡立新. 酶解制備花生肽[J]. 食品研究與開發(fā), 2010, 31(9): 174-177.

[13] JENS A N. Enzymic hydrolysis of food proteins[D]. London and New York: Elsevier Applied Science Publishers, 1986.

[14] CHAVAN V D, MCKENZIE D B, SHAHIDI F. Functional properties of protein isolates from beach pea(Lathyrus maritimus L.)[J]. Food Chem, 2001, 74: 177-187.

[15] SUN Weizheng, ZHAO Haifeng, ZHAO Qiangzhong, et al. Structural characteristics of peptides extracted from Cantonese sausage during drying and their antioxidant activities[J]. Innovative Food Science and Emerging Technologies, 2009, 10(4): 558-563.

[16] 史軍, 王金水, 蔡鳳英, 等. 花生蛋白酶解條件及活性肽抗氧化特性研究[J]. 河南工業(yè)大學學報: 自然科學版, 2006, 27(6): 29-33.

[17] BARRY H. Free radieals, antioxidants, and human disease: curiosity, eause or consequenee[J]. Laneet, 1994, 344: 721-724.

[18] 孫月梅. 大豆抗氧化肽酶法制備及其活性保護技術研究[D]. 哈爾濱: 東北農業(yè)大學, 2008.

[19] 孟凡莉. 花生肽的酶法制備、分離純化及其抗氧化活性研究[D]. 合肥: 合肥工業(yè)大學, 2010.

[20] 張宇昊. 花生短肽制備及其功能活性研究[D]. 北京: 中國農業(yè)科學院, 2007.

[21] 陳貴堂, 趙立艷, 叢濤, 等. Alcalase蛋白酶水解花生蛋白制備抗氧化肽的研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008, 29(3): 119-124.

Preparation of Peanut Antioxidant Peptides Using Dual-Enzyme Method

XIONG Liu，ZHAO Yun-xia，SUN Qing-jie*
(College of Food Science and Engineering, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China)

Alcalase and Flavourzyme were used to hydrolyze peanut meal for the preparation of antioxidant peanut peptides and the optimal process conditions were explored. The results showed that the optimal hydrolysis conditions for alcalase were alcalase concentration of 0.048 AU/g, substrate concentration of 4%, hydrolysis pH of 8.0, hydrolysis duration of 180 min and hydrolysis temperature of 60 ℃. The optimal hydrolysis conditions for Flavourzyme were Flavourzyme concentration of 15 LAPU/g, hydrolysis pH of 7.0, hydrolysis temperature of 50 ℃ and hydrolysis duration of 180 min. Under the optimal conditions, the yield of peanut peptide was up to 90.28%, and the DH of peanut meal was 33.73%. Meanwhile, the amount of peanut peptide with molecular weight less than 5000 D was up to 96.92%. The obtained peanut peptide has obvious antioxidant activity.

peanut；hydrolysis；bioactive peptides；Alcalase；Flavourzyme；orthogonal test

TS229；TQ936.1

A

1002-6630(2013)03-0207-05

2011-12-01

山東省科技發(fā)展計劃項目(2012gnc11306)；青島市公共領域科技支撐計劃項目(11-2-3-25-nsh)

熊柳(1975—)，女，講師，碩士，研究方向為糧油加工。E-mail：xiongliu821@163.com

*通信作者：孫慶杰(1970—)，男，教授，博士，研究方向為糧食、油脂與蛋白質工程。E-mail：phdsun@163.com