探討外周血hnRNP A2/B1診斷非小細(xì)胞肺癌的臨床意義

龍穎穎，古艷，李羲，顏春松，都莉

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006；2、南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江西南昌330006；3、海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

探討外周血hnRNP A2/B1診斷非小細(xì)胞肺癌的臨床意義

龍穎穎1，古艷2，李羲3，顏春松1，都莉2

(1、南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江西南昌330006；2、南昌大學(xué)第三附屬醫(yī)院，江西南昌330006；3、海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的探討外周血異質(zhì)性胞核核糖蛋白A2/B1(Heterogeneous nuclear ribnucleoprotein A2/B1,hnRNP A2/B1)對(duì)非小細(xì)胞肺癌臨床診斷意義，并分析吸煙對(duì)hnRNP A2/B1表達(dá)的影響。方法將2009年1月至2012年6月于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院行肺腫塊切除術(shù)41例非小細(xì)胞癌患者分成Ⅰ-Ⅱ期肺癌組17例、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組24例，此外隨機(jī)取肺部良性病變30例為對(duì)照組；又根據(jù)是否吸煙分成吸煙組34例，不吸煙組37例。抽提71例患者外周血及肺組織hnRNP A2/B1 mRNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)技術(shù)，分析3組患者h(yuǎn)nRNP A2/B1 mRNA在外周血及病變肺組織的表達(dá)差異；并分析吸煙對(duì)外周血及肺組織hnRNP A2/B1表達(dá)影響。結(jié)果hnRNP A2/B1在非小細(xì)胞肺癌患者外周血及病變肺組織中表達(dá)無顯著性差異(P＞0.05),在兩肺癌組患者外周血及肺組織的表達(dá)較良性病變組顯著升高，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);吸煙組hnRNP A2/B1基因表達(dá)較不吸煙組升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)論檢測(cè)外周血hnRNP A2/B1診斷非小細(xì)胞肺癌具有一定臨床意義；吸煙可能是誘導(dǎo)機(jī)體hnRNP A2/B1基因表達(dá)上調(diào)的因素。

異質(zhì)性胞核核糖核蛋白A2/B1；非小細(xì)胞肺癌；吸煙

隨著全球大氣污染日趨嚴(yán)重，肺癌的發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)逐年升高，發(fā)病率和死亡率高居所有腫瘤之首。肺癌診斷后5年生存率很低，早期診斷可以使I期腫瘤患者的5年生存率達(dá)到80%，因此早期診斷肺癌對(duì)提高患者生存率是至關(guān)重要的。目前早期診斷肺癌的方法有限，隨著的分子生物學(xué)的發(fā)展，很多學(xué)者致力于腫瘤標(biāo)志物的研究，現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)10余種與肺癌相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物[1]。hnRNP A2/B1是一種癌生長(zhǎng)蛋白，與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2,3]，本研究采用RT-PCR技術(shù)，分析hnRNP A2/B1基因在肺部良性疾病和非小細(xì)胞肺癌患者的外周血及肺病變組織的表達(dá)差異，探討其在非小細(xì)胞肺癌診斷中的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料71例患者于2009年1月至2012年6月來我院胸外科行肺部包塊切除術(shù)，術(shù)前未行化療及相關(guān)手術(shù)治療，術(shù)后經(jīng)細(xì)胞學(xué)(和)或病理組織學(xué)檢查，其中Ⅰ期～Ⅱ期肺癌組17例：鱗癌12例，腺癌5例；男9例，女8例。平均年齡：61.58± 15.63歲。Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組24例：鱗癌14例，腺癌7例，大細(xì)胞癌2例，肉瘤1例；男14例，女10例，平均年齡：60.13±16.39歲。肺良性病變組30例：錯(cuò)構(gòu)瘤14例，肺炎性假瘤5例，纖維瘤3例，其它8例；男19例，女11例，年齡51.57±23.83歲。71例患者依據(jù)WHO 1984吸煙調(diào)查方法標(biāo)準(zhǔn)化即每天吸煙1支以上，時(shí)間長(zhǎng)于1年為吸煙者的建議分吸煙組34例，不吸煙組37例。

1.2 方法

1.2.1 外周血及肺病變組織RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(1)外周血RNA獲?。盒g(shù)前抽取2ml外周血TRIzol法提取總RNA。(2)手術(shù)獲得肺病變組織約100mg，用含1‰DEPC的PBS(pH7.4)洗盡肺組織的血液，TRIzol法抽提肺組織RNA。取上述RNA 10μl，0.05μg/μl Oligo(dT)15 Primer 2μl及無核酶水2μl混勻，然后加入5×M-MLV Buffer 5μl、MMLV 1μl、RNasin 0.5μl、dNTP 1μl及無核酶水3.5μl混勻，用帶熱蓋的PCR儀42℃60min轉(zhuǎn)錄成cDNA產(chǎn)物。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)Oligo 6設(shè)計(jì)引物序列詳見表1，以hnRNP A2/B1基因的cDNA為模板設(shè)計(jì)一對(duì)上游和下游引物，擴(kuò)增片段280bp。此外，為檢測(cè)RNA提取效果及擴(kuò)增效率以β-actin為內(nèi)參設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增片段600bp。

表1 引物序列

1.2.3 PCR反應(yīng)及產(chǎn)物分析將cDNA進(jìn)行hn-RNP A2/B1和β-actin的PCR反應(yīng)。具體操作：(1) cDNA模板5.0μl，hnRNP A2/B1 Primer(10μM) 1.0μl，β-actin Primer(10μM)1.0μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5μl，ddH2O 5.5μl共計(jì)25μl反應(yīng)體系。(2)反應(yīng)條件：94.0℃預(yù)變性5.0min，94.0℃變性1.0min，60.0℃退火1.0min，72.0℃延伸2.0min，共35循環(huán)，最后72.0℃延伸7.0min。(3)結(jié)果分析：取PCR產(chǎn)物10.0μl及DNA Marker 5.0μl于2%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；所有資料均為計(jì)數(shù)資料，組與組間的比較均用χ2檢驗(yàn)，若四格表n＜40或T＜1則采用Fisher確切概率法。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01認(rèn)為有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

71個(gè)標(biāo)本均能成功地提取出總RNA(如圖1)，75.60%的肺癌組織以及65.85%的血液標(biāo)本中均有hnRNPA2/B1的基因表達(dá)；而肺部良性病變患者組織以及血液中hnRNPA2/B1的基因表達(dá)明顯減少，表達(dá)率分別為26.67%、20%(圖2、3)，具體基因表達(dá)情況見表2～5。

2.1 血液hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)血液中hn-RNP A2/B1基因表達(dá)在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.638，P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝7.284，P＜0.01);在Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝14.091，P＜0.01)；吸煙患者與不吸煙患者之間進(jìn)行比較均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝7.493，P＜0.01)，見表2和表3。

表2 3組血液hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)結(jié)果比較

表3 吸煙因素血液hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)肺組織hnRNP A2/B1基因表達(dá)在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.397, P＞0.05);在Ⅰ期-Ⅱ期肺癌組與肺良性病變組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝8.563，P＜0.01);Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組與肺良性病變組之間比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝14.700，P＜0.01)。組織中吸煙患者與不吸煙患者之間進(jìn)行比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝5.386，P＜0.05)。

2.3 血液與組織hnRNP A2/B1基因檢測(cè)結(jié)果比較本研究發(fā)現(xiàn)病變肺組織和血液的敏感性及特異性比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從表2和表4數(shù)據(jù)比較得出I期-Ⅱ期肺癌組血液與組織hnRNP A2/B1基因表達(dá)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.515,P＞0.05);同樣Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組血液與組織中檢測(cè)hnRNP A2/B1基因表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.444,P＞0.05)。

表4 三組肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)結(jié)果比較

表5 吸煙因素肺組織hnRNP A2/B1的基因檢測(cè)結(jié)果比較

圖1 總RNA電泳圖

圖2 血液標(biāo)本的β-actin電泳圖

圖3 血液陽性標(biāo)本電泳圖(在280bp處可見陽性條帶)

3 討論

HnRNP是一組核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白，由30多個(gè)蛋白質(zhì)小分子構(gòu)成復(fù)合體,其主要功能與RNA轉(zhuǎn)錄、外顯子剪接、剪接位點(diǎn)選擇以及Pre-mRNA的成熟和降解有關(guān)[3]。hnRNP A2/B1是hnRNP的主要組成部分，它可在核內(nèi)連接前RNA，并在RNA處理和連接位點(diǎn)的選擇中起重要作用；此外，可在核與胞質(zhì)間穿梭，具有將mRNA輸出到胞質(zhì)的功能；hnRNP還參與RNA的代謝、轉(zhuǎn)錄和DNA的復(fù)制[4-6]。hnRNP A2/B1在胚胎期正常肺發(fā)育的關(guān)鍵階段過度表達(dá)，表達(dá)水平與肺癌及癌前病變類似，在正常發(fā)育的成熟肺組織中的表達(dá)被抑制；其在肺癌中的表達(dá)類似于胚胎肺發(fā)育關(guān)鍵期，這種表達(dá)在蛋白質(zhì)和分子水平是一致的，表明hn-RNP A2/B1可能是一種癌生長(zhǎng)蛋白。近年來有研究表明hnRNP A2/B1表達(dá)異常與肺癌關(guān)系尤為密切[7-9]。本研究檢測(cè)Ⅰ-Ⅱ期肺癌組、Ⅲ期-Ⅳ期肺癌組及肺部良性病變?nèi)M樣本外周血以及肺組織中hnRNP A2/B1的基因表達(dá)。結(jié)果表明在Ⅰ-Ⅱ期早期肺癌組與肺部良性病變組之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；Ⅰ-Ⅱ期肺癌組其肺組織hnRNP A2/B1表達(dá)與血液比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。分析可能由于肺癌早期腫瘤生長(zhǎng)過程中組織細(xì)胞壞死后hnRNP A2/B1核酸釋放入血，導(dǎo)致血漿的mRNA濃度升高；此外，肺組織血供非常豐富，肺癌早期血液中可能已出現(xiàn)了hnRNP A2/B1異常表達(dá)，這與一些文獻(xiàn)報(bào)道相符[10，11]。由此看來，外周血hn-RNP A2/B1作為一種腫瘤標(biāo)志物對(duì)早期非小細(xì)胞肺癌進(jìn)行輔助診斷具有一定臨床意義。

本研究將吸煙患者與非吸煙者比較，發(fā)現(xiàn)吸煙組外周血以及組織中hnRNP A2/B1的基因表達(dá)陽性率分別為67.65%和70.58%，明顯高于不吸煙患組的35.14%和42.34%，兩組率之間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，這與Zhou的研究一致，推測(cè)吸煙可能為誘導(dǎo)機(jī)體hnRNP A2/B1基因表達(dá)上調(diào)的一個(gè)高危因素[12,13]。

在臨床工作中，肺腫塊切除術(shù)及肺腫塊活檢均為有創(chuàng)操作，且考慮到術(shù)后的腫瘤細(xì)胞可能種植擴(kuò)散，要獲取肺組織標(biāo)本非常困難。外周血標(biāo)本容易獲取，而綜合性醫(yī)院臨床檢驗(yàn)中心RNA提取和RT-PCR技術(shù)實(shí)施也比較普遍。因此檢測(cè)外周血hnRNP A2/B1的表達(dá)在非小細(xì)胞肺癌的早期診斷中有臨床可行性，與其它肺癌相關(guān)指標(biāo)聯(lián)合應(yīng)用將有助于肺癌臨床早期診斷，爭(zhēng)取早期救治，提高患者五年生存率。

[1]Hilbe W,Dirnhofer S,Greil R,Biomarkers in non-small cell lung cancer prevention[J].Eur J Cancer Prev,2004,13(5):425-36.

[2]Kozu T,Henrich B,Schffer KP.Structure and expression of the gene(HNRPA2B1)encoding the human hnRNP protein A2/B1[J]. Genomics,1995,25(2):365-371.

[3]Montuenga LM,Zhou J,Avis I,et al.Expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 changes withcritical stage of mammalian lung development[J].Am J Respir Cell Mol Biol,1998, 19(4):554-562.

[4]Moran-Jones K,Wayman L,Kennedy DD,et al.hnRNP A2,a potential ssDNA/RNA olecular adapter at the telomere[J].Nucleic Acids Res,2005,33:486-96.

[5]Nakielny S,Fischer U,Michael WM,et al.RNA transport[J].Annu Rev Neurosci,1997,20(3):269-301.

[6]Nichols RC,Wang XW,Tang J,et al.The RGG domain in hnRNP A2 affects subcellular localization[J].Exp Cell Res,2000,256(2): 522-532.

[7]Shi Y,Chen Y,Hou YY,et al.Role of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 protein in the pathogenesis of non-small cell lung cancer[J].Zhonghua Zhong Liu Za Zhi,2011,33(2):110-114.

[8]Jing GJ,Xu DH,Shi SL,et al.Aberrant expression and localization ofhnRNP-A2/B1isacommoneventinhumangastric adenocarcinoma[J].J Gastroenterol Hepatol,2011,26(1):108-115.

[9]Pino I,Pio R,Toledo G,et al.Altered patterns of expression of members of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein(hnRNP) family in lung cancer[J].Lung Cancer,2003,41(2):131-143.

[10]Tockman MS,Gupta PK,Myers JD,et al.Sensitive and specific monoclonal antibody recognition of human lung cancer antigen on preservedsputum cells:a new approach to early lung cancer detection[J].J Clin Oncol,1988,6(11):1685-1693.

[11]Tauler J,Zudaire E,Liu H,et al.HnRNP A2/B1 modulates epithelial-mesenchymal transition in lung cancer cell lines[J].Cancer Ras,2010,70(18):7137-7147.

[12]Lu ZT,Fu Q,Geng M,et al.Expression and its research of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 in non2small cell lung cancer[J].Prac J Med Pharm,2003,20(3):161-163.

[13]Zhou J,Mulshine JL,RoJ Y,et al.Expression of heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1 in bronchial epithelium of chronic smokers[J].Clin Cancer Res,1998,4(7):1631-1640.

Diagnostic value of the peripheral blood hnRNP A2/B1 in NSCLC patients

LONG Yingying,GU Yan,LI Xi,et al.The Second Affiliated Hospital of Nanchang University,Nanchang 330006,China

Objective To explore the value of detecting hnRNP A2/B1 in peripheral blood of non-small cell lung cancer，and to analyze the effects of smoking on the expression of hnRNP A2/B1 in non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods A total of 71 patients were excised lung mass in our hospital from January 2009 to June 2012,who were divided into three groups:17 patients with lung cancer in stageⅠ-Ⅱ，24 patients with lung cancer in stageⅢ-Ⅳand 30 patients with pulmonary benign lesions. There were 34 patients in smoking group and 37 were in non-smoking group.HnRNP A2/B1 mRNA was extracted from peripheral blood and lung tissue.The hnRNP A2/B1 mRNA expression was analyzed with RT-PCR technology,and the three groups of patients were compared with hnRNP A2/B1 mRNA in peripheral blood and diseased lung tissue;and influence of smoking on peripheral blood and lung tissue hnRNP A2/B1 expression was analyzed.Results The expression of hnRNP A2/B1 was no significant difference between the peripheral blood and the cancer tissue in the patients of lung cancer(P＞0.05).The expression of hnRNP A2/ B1 in patients with NSCLC was markedly higher than that in patients with pulmonary benign lesions(P＜0.01).The hnRNP A2/B1 in the smoking group was higher than that in the non-smoking group(P＜0.05).Conclusion Detection of peripheral blood hnRNP A2/ B1 is a valuable way of diagnosis on NSCLC.Smoking is a high risk factor on the upregulation of expression of hnRNP A2/B1 in human.

Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2/B1；NSCLC；Smoking

R734.2

A

1674-1129(2013)03-0217-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.03.006

江西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目編號(hào)(00183781511219043)江西省衛(wèi)生廳課題項(xiàng)目編號(hào)(20121188)

龍穎穎,男，38歲,畢業(yè)于南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，碩士，研究方

向肺癌的多耐藥性。