蝦蛄多肽的酶解工藝及其抗腫瘤活性的初步研究

林煥樂 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學院食品與藥學學院 醫(yī)學院，浙江 舟山 316004

蝦蛄多肽的酶解工藝及其抗腫瘤活性的初步研究

林煥樂 王澤峰 馬劍茵

浙江海洋學院食品與藥學學院 醫(yī)學院，浙江 舟山 316004

目的：通過正交試驗優(yōu)化酶解條件，提取分離蝦蛄軟體組織，根據其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。方法：采用L16（45）正交試驗設計方法，通過探索其抗前列腺癌作用，優(yōu)化胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的提取條件。結果：蝦蛄多肽酶解最佳條件為：料液比1∶2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時間為4h，其對前列腺癌PC－3細胞株的體外抑制率為60.9%。結論酶解所得的蝦蛄多肽對前列腺癌細胞具有一定的抑制生長作用。

蝦蛄多肽；酶解；前列腺癌細胞；正交試驗

近年來，有關生物活性肽的研發(fā)極為活躍，目前已有多種產品問世。來自海洋生物的活性肽盡管研發(fā)歷史較短，但因其具有的獨特生理功能而異軍突起，成為活性肽領域的研究熱點。海洋生物活性物質抗腫瘤研究是海洋生物活性物質開發(fā)與抗癌藥物研究的一個重要領域。從眾多的海洋生物中尋找有效的抗癌藥物，提取制備海洋生物活性物質并對其抗腫瘤活性進行篩選是其中的研究重點［1－3］。

蝦蛄在江浙一帶俗稱蝦拔彈、蝦鉤彈，在北方一帶俗稱蝦爬子，日本人稱之為螳螂蝦。它隸屬于節(jié)肢動物門、甲殼綱、口足目。蝦蛄與其他品種相比，具有能自然越冬、抗害避難和養(yǎng)殖風險小的優(yōu)點，值得推廣養(yǎng)殖［4］。近年來，規(guī)模化養(yǎng)殖蝦蛄的水產業(yè)越來越多。本文采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織，通過正交試驗優(yōu)化酶解條件，提取制備蝦蛄多肽，研究其體外抗腫瘤活性，篩選最佳酶解條件。

1 儀器與材料

1.1 材料 蝦蛄采集自舟山群島海域；前列腺癌細胞PC－3（原購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存）；胰蛋白酶等試劑均為國藥集團化學試劑有限公司 （分析純）。

1.2 主要儀器與設備 HH－S型水浴鍋（鞏義予華儀器有限責任公司）；FD－1000冷凍干燥機（上海愛朗儀器有限公司）；BS－100A自動部分收集器（上海瀘西分析儀器廠有限公司）；CR21G冷凍離心機（日本日立）；DHG－9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱 （上海一恒科技有限公司）；FiveEosy實驗室pH計；JJ－2組織搗碎機（上海梅香儀器有限公司）；RE－2000旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；EYELA CA－III循環(huán)冷凍儀（上海愛朗儀器有限公司）；SHB－III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科技有限公司）；Sephadex G－25凝膠柱。

2 實驗方法

2.1 酶解工藝 酶解工藝參照Sheih等［5］的方法，采用胰蛋白酶水解蝦蛄軟體組織。將蝦蛄洗凈去殼，將蝦蛄肉進行勻漿，用0.1mol/L的HCl和0.5mol/L的NaOH溶液調pH值，加入胰蛋白酶進行保溫水解，水解完成后100℃、10min進行滅酶，將水解液8000r/min離心20min，取上清液，旋轉蒸發(fā)，冷凍干燥。

2.2 細胞培養(yǎng) 選取人前列腺癌細胞PC－3（原購自中國科學院上海細胞庫，由本實驗室傳代保存），用含10%胎牛血清的F12完全培養(yǎng)基于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈單層貼壁生長，0.25%的胰蛋白酶消化，每2～3天傳代1次，實驗時選用對數(shù)生長期細胞。

2.3 細胞增殖抑制率的測定 采用MTT法檢測。配制PBS溶液（pH值為7.2）和分別配置上述16組正交實驗的蝦蛄多肽溶液。取對數(shù)生長期的前列腺癌PC－3細胞制成懸液，接種至96孔板，每孔200μL，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24h。然后分別加入不同酶解工藝制得的蝦蛄多肽（10mg/mL），每組分別設3個平行孔，同時設不加藥作為對照組，置5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中孵育72h。培養(yǎng)結束后，加PBS溶液（pH值為7.2）清洗3次，再加MTT繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸棄MTT，加二甲基亞砜每孔150μL，置酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm測吸光度，計算細胞增殖抑制指數(shù)（IR），按下列公式計算：

2.4 酶解工藝的影響因素和優(yōu)化 觀察A（料液比）、B（pH）、C（加酶量）、D（溫度）、E（時間）等因素對酶解工藝的影響，每個因素選四個水平進行L16（45）的正交實驗，比較胰蛋白酶在不同水解條件下的抗腫瘤活性，從而確定最佳酶解條件。

3 結果與討論

3.1 酶解工藝條件對抗腫瘤活性的影響

3.1.1 料液比對PC－3細胞增殖抑制率的影響

如圖1所示：在一定的料液比例下，隨著料液比的增

加，抗腫瘤活性下降，但當比例繼續(xù)增大時，抑制率又有所增加，料液比對胰酶酶解蝦蛄多肽有較大的影響。本實驗測得當料液比為1：2時，抗腫瘤活性最優(yōu)。

3.1.2 pH值對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖2所示：在一定的范圍內，隨著pH值的增加，抗腫瘤活性呈現(xiàn)先上升趨勢，再繼續(xù)增加pH值，抗腫瘤活性又有所下降，繼而又緩慢上升。本實驗測得當pH值為7.5時抗腫瘤活性最高。

3.1.3 加酶量對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖3所示：加酶量的改變，蝦蛄抗腫瘤活性呈現(xiàn)交替現(xiàn)象，當加酶量為500－1000u時抗腫瘤活性增加；當加酶量為1000－1500u時，抗腫瘤活性下降；繼續(xù)增加500u抗腫瘤活性又呈現(xiàn)下降趨勢。

3.1.4 酶解溫度對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖4所示，酶解溫度對胰蛋白酶酶解蝦蛄多肽的抗腫瘤活性變化明顯。在一定范圍內，隨著溫度增加，抗腫瘤活性上升，繼續(xù)增加溫度，抗腫瘤活性又下降。當溫度為40℃時，抗腫瘤活性最佳。

3.1.5 酶解時間對PC－3細胞增殖抑制率的影響 如圖5所示：隨著酶解時間的增加，抗腫瘤活性先緩慢增加，繼而呈現(xiàn)迅速下降，再逐漸趨于平緩。其中，4h時的抗腫瘤活性最強?？梢?，酶解時間對胰酶酶解蝦蛄多肽有一定的影響，以4h最優(yōu)。

3.2 正交實驗優(yōu)化酶解工藝

表1 Trypsin正交試驗設計及結果L16（45）

結果表明，影響前列腺癌PC－3細胞增殖抑制率的各因素的主次順序為：A（料液比）＞E（時間h）＞D（溫度℃）＞C（加酶量u/g）＞B（pH值）。IR值最大時的水解條件為A1B2C2D2E2，即料液比為料液比1：2，pH為7.5，加酶量為1000u/g，溫度40℃，時間為4h，其對前列腺癌PC－3細胞株的體外抑制率為60.9%。

4 討論

本實驗針對蝦蛄多肽體外抗前列腺癌PC－3細胞活性進行了正交試驗分析，篩選出了胰蛋白酶酶解的最優(yōu)條件，其抗腫瘤活性多肽的進一步分離純化以及作用機制有待于深入研究。

［1］歐陽高亮，李祺福，田長海.海洋生物抗腫瘤活性物質及其作用機理研究進展［J］.海洋科學，2003，27（7）：21－24.

［2］李盛英，鄭忠輝.國外海洋抗腫瘤活性物質的研究與開發(fā) ［J］.海洋通報，2003，22（2）：76－82.

［3］洪水根.海洋生物活性物質在腫瘤治療及臨床檢測中的應用 ［J］.廈門科技，2003，2：55－58.

［4］曹根庭，裘迪紅，張義浩，等.蝦蛄的綜合利用 ［J］.浙江水產學院學報，1996，15（1）：74－76.

［5］Sheih JC，Wu TK，F(xiàn)ang TJ.Antioxidant properties of a new antioxidative peptide from algae protein waste hydrolysate in different oxidation saystems［J］. Bioresour Technol，2009，100：3419－3425.

R931.4

A

1007－8517（2013）10－0016－03

2013.04.15）

林煥樂（1990－），女，大學本科.

馬劍茵※（1962－），女，教授，碩士生導師，從事海洋生物活性成分的藥理研究.E－mail：chymjy＠zjou.edu.cn.