嗅鞘細胞移植對面神經干缺損的修復研究△

顧健 朱秋蓓 朱艷玲 徐亞平 戴尉君 范靜平

嗅鞘細胞移植對面神經干缺損的修復研究△

·基礎研究·

顧健 朱秋蓓 朱艷玲＊徐亞平 戴尉君 范靜平

目的探討嗅鞘細胞（OECs）移植對面神經干缺損治療的療效。方法健康SD大鼠40只，雌雄不限，隨機分為4組，每組10只。分為正常對照組、模型組、治療組1和治療組2。正常對照組，未予特殊處理。模型組均建立一側（左側）面神經顳外段總干缺損10 mm的動物模型。治療組1和治療組2均建成模型后用自制神經導管套接吻合神經缺損。治療組1：在神經導管里注入等量無菌生理鹽水。治療組2：在神經導管內移植0.1mL以調整好濃度的OECs；各組分別于8周和12周檢測面神經誘發(fā)電位，利用潛伏期和波幅做組間t檢驗。結果8周和12周后移植OECs組的面神經誘發(fā)電位的潛伏期與波幅均有所恢復，與模型組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。結論移植的OECs輔以神經導管對面神經干缺損的治療有一定的效果，可以作為面神經干缺損治療的進一步研究。（中國眼耳鼻喉科雜志，2013，13：137-140）

面神經損傷；嗅鞘細胞；神經導管；誘發(fā)電位

隨著對嗅鞘細胞（olfactory ensheathing cells，OECs）的深入研究，近年來OECs在神經損傷中的應用已成為可能，并取得了相當大的成果［1-3］。本研究利用OECs促進神經損傷的修復，從而達到損傷神經功能的部分或完全恢復；并利用組織工程學原理，模仿神經組織的構造，以硅膠管作為支架替代神經外膜，用膠原蛋白海綿作為胞外基質和再生橋，局部移植OECs。以面癱癥狀的評分及神經電生理作為面神經功能評價指標，觀察缺損面神經干的功能改善或恢復情況，以探究OECs移植對面神經干缺損的修復效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 SD大鼠（體質量200～300 g）40只，雌雄不限，購自第二軍醫(yī)大學動物中心，飼養(yǎng)于第二軍醫(yī)大學神經生物實驗室。DMEN/F12、胎牛血清、2.5g/L胰酶購自美國Gibco公司；山羊抗兔二氨基聯(lián)苯胺顯色二抗試劑盒和多克隆兔抗人p75購于美國Millipore公司，硅膠管購自濟南醫(yī)用硅橡膠制品廠，膠原蛋白海綿購自無錫貝迪生物工程公司。血細胞計數(shù)板、臺式低速離心機、倒置相差熒光顯微鏡、電子刺激器、光學顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 健康SD大鼠40只，隨機分為4組，每組10只，每組于術后4周和8周分別進行檢測。正常對照組，未手術處理與其他組同等喂養(yǎng)。模型組均建立一側（左側）面神經總干缺損10 mm的動物模型。治療組1和治療組2均建成模型后用自制神經導管套接吻合神經缺損。治療組1：在神經導管里注入0.1mL無菌生理鹽水。治療組2：在神經導管內移植0.1mL已調整好濃度的OECs。

1.2.2 OECs的分離培養(yǎng)與純化、鑒定 取SD大鼠6只，無菌分離嗅球，盡量剝離腦膜，剪成小組織塊，用0.25％胰酶消化，然后用添加胎牛血清、谷氨酰胺、青霉素、鏈霉素的全培養(yǎng)基（DMEM/F12 1∶1）中和胰酶。經吸打后接種于培養(yǎng)瓶中，然后按照改良的Nash差時貼壁法結合阿糖胞苷法純化OECs。于第10天取部分OECs用多克隆兔抗人p75（1∶500）進行鑒定，使用軟件定量技術計算p75 MR陽性細胞百分率，待陽性率為90％以上時，將細胞濃度調整為1×1010/L，待用（圖1）。

圖1A.OECs的GFAP染色（×200），箭頭示綠色染色為OECs膜質 圖1B.OECs的Hoechst染色（×200），箭頭示藍色染色為OECs核圖1C.OECs的S-100染色（×200），紅色示OECs膜質，如箭頭所示

1.2.3 神經導管的制備 將硅膠管（內徑2.0 mm，外徑2.1mm）剪成10mm長，浸泡于75％乙醇消毒30 min，用無菌生理鹽水沖洗備用。無菌條件下將膠原蛋白海綿剪成長7mm、直徑2mm的圓柱體，導入硅膠管作內支架，完成神經導管的構建。

1.2.4 實驗動物手術 用10％水合氯醛麻醉，在莖乳孔外分離暴露面神經顳外段總干。切去一段長6 mm的面神經上頰支，任其回縮，造成10 mm神經缺損的動物模型。2個治療組均用自制神經導管套接吻合神經缺損，內置膠原蛋白海綿后將兩神經斷端各嵌入導管內2.5mm，將兩端神經外膜與硅膠管壁縫合。治療組2用微量加樣器將標記好的OECs懸液0.1mL注入神經導管內，治療組1向管腔內注入等量生理鹽水，然后分層縫合傷口。所有步驟均在手術顯微鏡下進行。所有動物術后3 d均給以30萬U青霉素肌內注射，1次/d，于第二軍醫(yī)大學神經生物實驗室分籠飼養(yǎng)，標準食水飼養(yǎng)至術后8周和12周。

1.3 觀察指標

1.3.1 面部及大體觀察 分別于術后8周和12周觀察切口外表有無異常紅腫及炎性分泌物，并根據(jù)大鼠的瞬目反射、觸須運動和鼻尖位置進行評分。根據(jù)不同組別的評分結果進行比較。

1）瞬目反射。用5 mL注射器裝18G針頭，距大鼠眼睛2 cm處，瞬間向眼內吹入空氣，觀察大鼠眼瞼活動及閉合情況：①2分為雙側無明顯差異；②1分為患側較對側閉合延遲；③0分為患側眼瞼不能閉合。

2）觸須活動。計數(shù)30s內雙側觸須：①2分為雙側觸須活動無明顯差異；②1分為患側觸須活動較對側減弱；③0分為患側觸須活動消失。

3）大鼠鼻尖位置：①2分為鼻尖居中；②1分為鼻尖偏向對側。

1.3.2 神經電生理檢測 應用電子刺激器（SEN-3201，光電公司，日本）在面神經遠端刺激神經，給予幅值為20 mV、時程為100～200 ms、頻率為1 Hz的刺激脈沖。在中樞端（靠近面神經出莖突孔處）用銀絲電極記錄面神經的動作電位，信號經前置放大器放大（5 000倍，濾波1 K，時間常數(shù)0.25）后，用平均疊加儀疊加（疊加64次）信號顯示在示波器，然后記錄并計算動作電位的幅值及時程。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，實驗結果采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用t檢驗。檢驗水準a=0.05。

2 結果

2.1 大體觀察 術后4周和8周，40只實驗鼠均正常存活。切口外表無異常紅腫及炎性分泌物。面神經功能見表1。

表1 各組不同時間段評分值（分）

2.2 神經電生理學測定（圖2、表2）

從表2可以看出8周和12周后，治療組2與同期模型組比較，在導管及支架材料條件下局部注入的OECs使面神經誘發(fā)電位的潛伏期明顯縮短（P＜0.01），并使面神經誘發(fā)電位的幅值明顯升高（P＜0.01），結果都具有統(tǒng)計學意義。治療組2與治療組1比較（P＜0.05）、治療組1與同期模型組比較（P＜0.05），結果都具有統(tǒng)計學意義。

另外可以看出，8周和12周后，治療組2面神經誘發(fā)電位的潛伏期與波幅均有所恢復，但與同期正常對照組比較仍未完全恢復。

圖2A.12周正常對照組誘發(fā)電位圖；圖2B.12周正常對照組誘發(fā)電位圖；圖2C.12周正常對照組誘發(fā)電位圖；圖2D.12周正常對照組誘發(fā)電位圖。白色箭頭示面神經誘發(fā)電位潛伏期，黑色箭頭示誘發(fā)電位波幅

表2 術后8周和12周誘發(fā)電位潛伏期和波幅值比較（n=10）

3 討論

面神經損傷在耳面部外傷中較為常見，針對不同的損傷類型，臨床上常采取保守藥物治療或外科手術。后者如自體神經移植治療，但自體神經來源有限、取材后易造成繼發(fā)感染和畸形，因而限制了它在臨床的應用。而OECs相對易于獲取且來源豐富，使之在神經損傷修復中的應用已成為研究重點，并取得了相當大的成果。有研究［1-3］通過實驗證明，OECs對于脊髓損傷、腦卒中和周圍神經損傷、帕金森病等都有一定的療效。Guntinas-Lichius等［4］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠面神經橫斷后于損傷處移植嗅黏膜組織可明顯促進損傷面神經的再生和功能恢復。關于OECs移植后可能的作用機制尚不明確，主要包括以下幾個方面：①移植后的OECs下調了反應性星形細胞膠質纖維酸性蛋白和蛋白多糖的表達，降低了這些物質的反應，從而為軸索的再生提供了良好的保護環(huán)境［5-6］；②OECs有一定的遷徙能力，能伴隨再生軸索跨越膠質瘢痕形成的抑制環(huán)境，促進部分下降通路的發(fā)芽、再生［7-8］；③OECs表達和分泌的多種黏附分子及神經營養(yǎng)因子幫助神經元存活并促進軸索生長，同時對再生軸索提供趨化導引作用［9-10］；④防止殘留神經纖維的激發(fā)性脫髓鞘，幫助再生軸索髓鞘再生，保證傳導的完整性［11-13］。另外OECs是一種移植免疫缺陷細胞，這也有助于其作為神經損傷移植或修復的良好候選種子細胞。

本實驗主要通過面癱癥狀評分、面神經誘發(fā)電位的潛伏期和波幅對OECs移植的療效進行判定。實驗結果顯示，OECs組的治療效果與其他組比較有明顯差異。這證實了OECs具有改善損傷周圍神經修復的功能。

本實驗還對治療組1和模型組的治療結果進行比較，證實神經導管對面神經功能的改善與恢復也具有很大影響。神經導管內部支架的構建對神經再生有重要影響。適宜的內部支架可以增加導管內表面的粗糙程度，使細胞與導管間的相互作用增加，從而克服了導管對細胞親和力較差的缺點，支持細胞的貼附、分化和軸突再生神經導管具有特定的三維結構，可接納再生的軸突長入，規(guī)定了再生軸突的方向性［14-15］。Lundborg等［16］用硅膠管制成外支架，管內用八聚酰胺絲作為內支架，成功引導大鼠再生軸突通過15 mm的神經缺損。Nakamura等［17］將膠原海綿填充于聚乳酸導管內制成人工支架，橋接狗15 mm腓神經缺損，收效良好。據(jù)此，我們采用硅膠管和膠原蛋白海綿。硅膠管具有組織相容性好、無生物毒性、物理性能穩(wěn)定、不會塌陷的優(yōu)點。膠原蛋白是細胞外基質的組成部分，是細胞賴以生存和維持細胞功能的生物學基礎［18-19］。利用特殊工藝制成的膠原蛋白海綿具有更高的面積/體積比，能為移植細胞提供更大的黏附表面，攜帶更多的移植細胞［20-21］。

總之本實驗表明，在面神經干斷裂的情況下，以OECs作為種子細胞，以硅膠管為支架，以膠原蛋白海綿為內在填充物代替細胞外基質，最終改善或恢復損傷面神經的功能效果理想。但本實驗對細胞分子層面進行面神經功能改善的具體機制尚未闡明，故需進一步研究。

［1］Kubasak MD，Jindrich DL，Zhong H，etal.OEG implantation and step training enhance hindlimb-stepping ability in adult spinal transectedrats［J］.Brain，2008，131：264-276.

［2］Li Y，Li D，Khaw PT，et al.Transplanted olfactory ensheathing cells incorporated into the optic nerve head ensheathe retinal ganglion cell axons：Possible relevance to glaucoma［J］.Neurosci Lett，2008，440（3）：251-254.

［3］Su Z，He C.Olfactory ensheathing cells：biology in neural development and regeneration［J］.Prog Neurobiol，2010，92（4）：517-532.

［4］Guntinas-Lichius O，Wewetzer K，Tomov TL，et al.Transplantation of olfactory mucosa minimizes axonal branching and promotes the recovery of vibrissae motor performance after facial nerve repair in rats［J］.JNeurosci，2002，22（16）：7121-7131.

［5］Guan CB，Xu HT，Jin M，et al.Long-range Ca2+signaling from growth cone to somamediates reversal of neuronalmigration induced by slit-2［J］.Cell，2007，129（2）：385-395.

［6］Krum JM，Khaibullina A.Inhibition of endogenous VEGF impedes revascularization and astroglial proliferation：roles for VEGF in brain repai［J］.Exp Neurol，2003，181（2）：241-257.

［7］Su Z，Cao L，Zhu Y，et al.Nogo enhances the adhesion of olfactory ensheathing cells and inhibits their migration［J］.JCell Sci，2007，120（pt11）：1877-1887.

［8］Imaizumi T，Lankford KL，Waxman SG，et al.Transplanted olfactory ensheathing cells remyelinate and enhance axonal conduction in the demyelinated dorsal columns of the rat spinal cord［J］.JNeurosci，1998，18（16）：6176-6185.

［9］Lipson AC，Widenfalk J，Lindqvist E，etal.Neurotrophic properties of olfactory ensheathing glia［J］.Exp Neurol，2003，180（2）：167-171.

［10］Chung RS，Woodhouse A，F(xiàn)ung S，etal.Olfactory ensheathing cells promote neurite sprouting of injured axons in vitro by direct cellular contact and secretion of soluble factors［J］.Cell Mol Life Sci，2004，61（10）：1238-1245.

［11］Podratz JL.Role of the extracellularmatrix inmyelination of the peripheral nerve［J］.Glia，2001（1），35：35-40.

［12］Lu J.Transplantation of nasal olfactory tissue promotes partial recovery in paraplegic adult rats［J］.Brain Res，2001，889（1-2）：344-357.

［13］Boruch AV，Conners JJ，Pipitone M，et al.Neurotrophic and migratory properties of an olfactory ensheathing cell line［J］.Glia，2001，33（3）：225-229.

［14］Wang K，Hu W，Cao Y.Dog sciatic nerve regeneration across a 30-mm defect bridged by a chitosan/PGA artificial nerve graft［J］.Neurosurgery，2005，128：1897-1910.

［15］Inada Y，Morimoto S，Takakura Y，et al.Regeneration of peripheral nerve gaps with a polyglycolic acid-collagen tube［J］.Neurosurgery，2004，55（3）：640-648.

［16］Lundborg G，Dahlin L，Dohi D，et al.A new type of bioartificial nerve graft for bridging extended defects in nerve［J］.JHan Surg，1997，22（3）：299-304.

［17］Nakamura T，Inada Y，F(xiàn)ukuda S，et al.Experimental study on the regeneration of peripheral nerve gaps through a polyglycolic acidcollagen（PGA-collagen）tube［J］.Brain Res，2004，027（1-2）：18-29.

［18］劉世清，李皓桓，彭吳，等.毗咯哇咐醒充填導管誘導外周神經再生的實驗研究［J］.中華顯微外科雜志，2005，28（2）：145-147.

［19］張治軍，高炳慶，梁傳余，等.胰島素樣生長因子對面神經損傷的修復作用［J］.中國中西醫(yī)結合耳鼻咽喉科雜志，2004，12（1）：7-9.

［20］顏文龍，孫恩杰，郭海英，等.組織工程支架材料［J］.上海生物醫(yī)學工程雜志，2004，25（1）：51-54.

［21］Badylak SF.The extracellu lar matrix as a scaffold for tissue reconstruction［J］.Semin Cell Dev Biol，2002，13（5）：377-383.

Primary study of olfactory ensheathing cell transplantation in facial nerve defect ratmodel GU Jian，ZHU Qiu-

pei，ZHU Yan-ling＊，XU Ya-ping，DAIWei-jun，F(xiàn)AN Jing-ping.Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai 200003，China

FAN Jing-ping，Email：fanjingp＠163.com

ObjectiveTo investigate the therapeutic effect of olfactory ensheathing cell transplantation in facial nerve defect ratmodel.M ethods Forty SD rats were randomly divided into four groups of 10 in each：Control group（CG），Model group（MG），Treatment group1（TG1）and Treatment group 2（TG2）.In CG，the rats were untreated.In MG，the temporal segments of facial nerveswere cut off to form 10mm defects on the left side of the rats.In TG1 and TG2，neural tubes weremade to joint the nerve defects.TG1：inject sterile saline in the neural tube.TG2：transplant 0.1mLOECs in the neural tube.The facial nerve evoked potentials were detected in 8 and 12 weeks after the injection respectively.The t testwas used to analyze the latency and amplitude of the evoked potentials.Results The latency and amplitude of the facial nerve evoked potentials were all increased in 8 and 12 weeks after OECs transplantation in the model group（P＜0.01）.The results were statistically significant.Conclusions Olfactory ensheathing cells transplantation was effective in the ratmodel of neural tube defects，and it could be served as a potential treatment in facial nerve defect for further research.（Chin JOphthalmol and Otorhinolaryngol，2013，13：137-140）

Facial nerve injury；Olfactory ensheathing cells；Neural tube；Evoked potentials

2012-10-09）

（本文編輯 楊美琴）

中國人民解放軍軍隊“十二五”重點項目（BWS11C035）

第二軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院耳鼻喉-頭頸外科 上海 200003；＊第二軍醫(yī)大學神經科學研究所 上海 200433

范靜平（Email：fanjingp＠163.com）