HPLC法測定清肝顆粒中黃芪甲苷的含量

蘇華麗 林善遠

（1廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院藥劑科，肇慶526060；2廣東省新興中藥學校，新興527400）

HPLC法測定清肝顆粒中黃芪甲苷的含量

蘇華麗1林善遠2

（1廣東省肇慶市第一人民醫(yī)院藥劑科，肇慶526060；2廣東省新興中藥學校，新興527400）

目的 建立清肝顆粒中黃芪甲苷的含量方法。方法 采用HPLC法，色譜柱：Agilent Hypersil C18柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相：甲醇-水（25∶75），檢測波長：201nm，流速：1.0mLμmin-1，柱溫：室溫，進樣量：10μL。結果 黃芪甲苷在0.0824～2.06μg范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，r=0.9998；平均回收率為100.90%，RSD=1.92%（n=6）。結論 該方法準確、重復性好，可用于清肝顆粒的質(zhì)量控制。

清肝顆粒；黃芪甲苷；HPLC法；含量測定

清肝顆粒是根據(jù)臨床經(jīng)驗方研制而成的，主要由黃芪、苦參、桅子、甘草等12味中藥材組成，具有清熱利濕，扶正祛邪的功能，適用于急性黃疸型肝炎［1］。黃芪來源于豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch．）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch．）Bge．的干燥根，具有補氣升陽，利水消腫的功效［2］，在方中為君藥，現(xiàn)代研究表明黃芪的主要有效成分為黃芪甲苷。為了對該制劑的質(zhì)量進行控制，以確保臨床療效，筆者參考相關文獻［3-5］建立了高效液相法測定其中黃芪甲苷的含量。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：Summit P680A泵，Summit PDA-100二級管陣列檢測器，Chromeleon色譜工作站（美國DIONEX）；電子分析天平（十萬分之一，德國Sartorius）；H6605T超聲清洗機（無錫超聲電子設備廠）；黃芪甲苷對照品（供含量測定用，批號110781-200801）由中國藥品生物制品檢定所提供，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件色譜柱：Agilent Hypersil C18（4.6mm× 250mm，5μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）；檢測波長：201nm；流速：1.0mLμmin-1；柱溫：室溫；進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的制備精密稱取黃芪甲苷對照品8.24mg，用甲醇溶于50m L容量瓶中，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備取本品10g，研細，再精密稱取2g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率200W，頻率40k Hz）50min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液25mL，揮干，殘渣加水20mL加熱使溶解，移入分液漏斗中，重復操作2次，合并提取液，用水飽和的正丁醇振搖提取4次（60、40、40、40mL），合并正丁醇液，用氨試液洗滌3次，每次40mL，棄去氨液，回收正丁醇至干，用10mL甲醇溶解殘渣，移至25mL容量瓶中，甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性對照溶液的制備去除黃芪藥材，按處方比例和制備工藝配制不含黃芪的陰性對照樣品，按“2.3”項下方法，制成陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，結果在該色譜條件下，黃芪甲苷與其他成分可達基線分離，分離度均大于1.5。陰性對照圖譜中在對照品色譜峰位置上未見其他成分對測定有干擾，黃芪甲苷色譜峰的保留時間約為8.2min。對照品色譜峰與供試品色譜中相對應色譜峰的紫外光譜吸收均一致。結果表明在上述色譜條件下對黃芪甲苷具有良好的分離效果。

2.6 線性關系考察精密吸取“2.2”項下黃芪甲苷對照品溶液1、5、10、15、20、25μL注入色譜儀，測定色譜峰面積，以峰面積積分值與對照品進樣量（μg）進行線性回歸，回歸方程和相關系數(shù)分別為y=465.17x-0.568，r=0.9998。結果表明黃芪甲苷在0.0824～2.06μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗分別精密吸取“2.2”項下黃芪甲苷對照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，重復測定6次，以黃芪甲苷峰面積積分值計算RSD為0.32%（n=6），結果表明儀器的精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗精密吸取同一供試品溶液各10μL，分別在1、2、4、6、8、12h依次進樣，測定，以黃芪甲苷峰面積積分值計算RSD為1.88%（n=6），結果表明所制備的樣品12小時內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 重復性試驗稱取同一批樣品（批號：20120301）6份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試品溶液各10μL，按“2.1”項下色譜條件進樣，測得黃芪甲苷平均值為1.76mg-1，RSD為1.35%（n=6）。結果表明該方法的重復性較好。

2.10 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的同一批樣品（批號：20120301）6份，每份約0.5g，每組兩份，按高、中、低3種濃度分別精密加入適量黃芪甲苷對照品溶液，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，并按規(guī)定的色譜條件測定，計算回收率，結果黃芪甲苷平均回收率為100.90%，RSD=1.92%（n=6），結果見表1，表明該方法的回收率良好。

表1 加樣回收率測定結果

2.11 樣品測定取3個批次的清肝顆粒，分別依法測定，結果見表2。

表2 樣品測定結果（n=3，%）

3 討論

3.1 關于測定方法的選擇黃芪甲苷的含量測定有多種方法，過去多采用薄層掃描法、比色法及熒光法等，由于存在穩(wěn)定性、重復性相對較差、方法誤差較大，以及共存組分干擾嚴重等問題，本研究選擇了HPLC法。由于黃芪甲苷紫外檢測僅在波長200nm左右有末端吸收，文獻中多用蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）檢測［6-8］，2010年版《中華人民共和國藥典》一部也采用該方法［2］。一方面ELSD價格昂貴，另一方面與HPLC連接時需要信號轉(zhuǎn)換，還需要配置高壓氮氣或空氣，從實用角度出發(fā)，本實驗仍選用UV法。

3.2 流動相的選擇研究過程中對比了不同比例的乙腈-水和甲醇-水，隨著水相的增加黃芪甲苷出峰時間前移，但峰形和雜質(zhì)峰有一定影響，從經(jīng)濟角度綜合考慮采用甲醇-水（25∶75）為流動相，出峰時間，分離效果均較為理想。

4 結論

本文所建立方法經(jīng)方法學驗證具有良好的精密度、準確度和重復性，能夠準確測定黃芪甲苷含量，可用于清肝顆粒的質(zhì)量控制。根據(jù)實驗結果，暫定本品每1g含黃芪甲苷（C41H68O14）不低于1.35mg。

［1］蘇華麗，林善遠.清肝顆粒的防潮工藝研究［J］．中國醫(yī)藥指南，2011，9（25）：209-211．

［2］國家藥典委員會．中華人民共和國藥典．一部［S］．北京：化學工業(yè)出版社，2010：283-284．

［3］施旭光，許曉峰，朱偉，等．HPLC測定黃芪桂枝五物湯及方中藥對的黃芪甲苷含量［J］．中國實驗方劑學雜志，2006，12（2）：20-22．

［4］孫聰，韓業(yè)超，吳強．高效液相色譜法測定保元清血顆粒中黃芪甲苷含量方法的建立及評價［J］．吉林大學學報（醫(yī)學版），2012，88（4）：804-808．

［5］徐忠坤，徐海娟，宋娟，等．HPLC法測定芪葛顆粒中黃芪甲苷［J］．中草藥，2011，42（1）：94-95．

［6］李丹．高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測法測定芪麥益氣口服液中黃芪甲苷的含量［J］．醫(yī)藥導報，2010，29（7）：941-942．

［7］Wang W T，Zhao Z Y，Han Y M，et al．Effects of astragalosideⅣderivative on heart failure in rats［J］．Chin Herb Med，2010，2（1）：48-53．

［8］吳青業(yè)，周恩麗，付小環(huán)，等．HPLC-ELSD法測定芪葛口服液中黃芪甲苷［J］．中草藥，2010，41（8）：1305-1306．

De te r mina tion t h e Con t en t s o f As t r agalo sid e in Qin g gan Gr anule s b y HPLC

Du Huali Lin Dhanyuan
（1 Department of Pharmacy，The First People's Hospital of Zhaoqing，Zhaoqing 526060，China；2 Xinxing Dchool of Traditional Chinese M edicine，Guangdong Xinxing 527400，China）

Objective To establish a method to determine the contents of astragaloside in Qinggan Granules．Methods The HPLC was applied with the condition as follows：column：agilent Hypersil C18（4．6mm×250mm，5μm）；mobile phase：methanol-water（25：75）；detection：201nm；flow speed：1．0m Lμmin-1，Column temperature：room temperature；Injection volume：10μL．Results The calibration curves were linear within the range of 0．0824～2．06μg for astragaloside，with their average sample adding rate of recovery 100.90%（RSD=1.92%）.Conclusion This accurate and reproducible method can be used to control the quality of Qinggan Granules．

Qinggan Granules；Astragaloside；HPLC；Content

10.3969／j.issn.1672-2779.2013.09.091

1672-2779（2013）-09-0138-02

張文娟

2013-04-28）