低出生體重小鼠模型制備及左、右歸丸對(duì)其骨髓細(xì)胞數(shù)量及功能的影響

降央澤仁 黃 茜 黃曉芹

成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 610075

低出生體重小鼠模型制備及左、右歸丸對(duì)其骨髓細(xì)胞數(shù)量及功能的影響

降央澤仁 黃 茜 黃曉芹

成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 610075

目的：研究左、右歸丸對(duì)先天之精不足之低出生體重小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)量及功能的影響，探究左、右歸丸補(bǔ)腎作用的生物學(xué)實(shí)質(zhì)。方法：通過孕鼠饑餓法得到低出生體重小鼠，仔鼠自5～10周，分別灌胃左、右歸丸后，檢測骨髓有核細(xì)胞數(shù)、骨髓各系造血祖細(xì)胞集落產(chǎn)率、骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附能力并與正常和灌胃生理鹽水及未灌胃組比較。結(jié)果：模型組新生仔鼠體重極顯著低于正常組新生仔鼠；各模型組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)均低于正常小鼠；右歸丸組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量顯著高于生理鹽水組；模型小鼠各組的CFU－GM、CFU－E、BFU－E祖細(xì)胞集落產(chǎn)率和生理鹽水組、空白組的CFU－Meg集落產(chǎn)率均極顯著低于正常小鼠；右歸丸組CFU－GM集落產(chǎn)率、左歸丸CFU－E、CFU－Meg集落產(chǎn)率分別高于生理鹽水組；基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的7、14、21天，空白組和生理鹽水組的基質(zhì)細(xì)胞黏附能力均顯著低于正常組，在第7天，左、右歸丸組基質(zhì)細(xì)胞黏附能力均顯著低于正常組、顯著高于模型空白和模型鹽水組；在14天和21天時(shí)，左右歸丸組與正常組相比無差異；且在14天時(shí)，右歸丸高于生理鹽水組；在21天時(shí)，左、右歸丸組均高于生理鹽水組。結(jié)論：孕鼠饑餓法得到的低出生體重小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)量和部分功能顯著低于正常小鼠，左、右歸丸能不同程度、不同角度地促進(jìn)低出生體重小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)量提高和功能恢復(fù)。這可能是左、右歸丸對(duì)先天之精不足小鼠發(fā)揮“補(bǔ)腎”作用的途徑之一。

低出生體重；小鼠模型；左歸丸；右歸丸；骨髓細(xì)胞

近年來，部分學(xué)者開始注意到干細(xì)胞與先天之精間的相似性，從干細(xì)胞角度對(duì)先天之精和腎為先天之本的理論進(jìn)行了討論［1－4］，提出了從干細(xì)胞角度探討腎精和腎為先天之本的思路。我們在這一理論指導(dǎo)下，研究了中醫(yī)常用補(bǔ)益劑左、右歸丸對(duì)低出生體重的先天不足小鼠骨髓細(xì)胞的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 10周齡C57BL6J小鼠，購買于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要藥品及試劑 左歸丸：河南省宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z41020696，右歸丸：河南省宛西制藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z41022170，IMDM培養(yǎng)基：美國Invitrogen公司，馬血清：北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所，重組人促紅細(xì)胞生成素：上海普欣生物技術(shù)有限公司，重組小鼠白細(xì)胞介素－3，重組小鼠粒單系集落刺激因子：Peprotech，重組小鼠促血小板生成素：Peprotech，瓊脂粉：日本Solarbio公司。

1.3 儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱：MCD－15A型，日本SANYO公司；超凈工作臺(tái)：SW－CJ－2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；倒置相差顯微鏡：Olympus IMT－2型；24－48孔細(xì)胞培養(yǎng)板：加拿大JET Biochemical Int′l；Inc，等。

1.4 低出生體重小鼠模型的制備 綜合參考劉殿峰［5］、程志清［6］等人的方法進(jìn)行，具體操作見表1。

1.5 動(dòng)物分組及處理 5周齡正常幼鼠（雌雄隨機(jī)）為正常組、5周齡模型幼鼠（雌雄隨機(jī)）分為空白組、左歸丸組、右歸丸組、生理鹽水組，每組10只。除正常組、空白組外，其余各組分別灌胃生理鹽水、左歸丸（3.0g· kg－1）、右歸丸（3.0 g·kg－1）和等體積生理鹽水，bid×5周。最后一次灌胃后24小時(shí)，處死小鼠，分離小鼠股骨骨髓細(xì)胞（bone marrow cell，BMC），分別進(jìn)行骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)、常規(guī)祖細(xì)胞集落培養(yǎng)計(jì)數(shù)和基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)。在基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)第7d、14d、21d進(jìn)行基質(zhì)細(xì)胞的粘附力測定。測定時(shí)吸出培養(yǎng)液，PBS輕輕沖洗2次，去除懸浮細(xì)胞后，各孔加入細(xì)胞密度為5×105/ml正常小鼠BMC 1ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后，用培養(yǎng)液輕輕沖洗2次，收集并計(jì)數(shù)未粘附的BMC，按下列公式計(jì)算骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)正常BMC的粘附能力：

粘附力＝（1－未粘附細(xì)胞數(shù)/5×105）×100%

表1 低出生體重小鼠模型的制備過程

1.6 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，P＜0.05視為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 低出生體重小鼠造模結(jié)果 實(shí)驗(yàn)中得到的正常組新生仔鼠和模型組新生仔鼠，體重分別為1.489±0.165和1.259±0.128（g/只），P＜0.01。

2.2 骨髓有核細(xì)胞數(shù)的變化（見表2）

表2 灌胃左、右歸丸后低出生體重小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)（×109個(gè)）

可見，低出生體重小鼠的骨髓有核細(xì)胞數(shù)均低于正常小鼠（P＜0.01）；灌胃左歸丸后，低出生體重小鼠的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量顯著高于空白組但與生理鹽水組相比無顯著差異（P＞0.05）；灌胃右歸丸組則顯著高于空白組和生理鹽水組（P＜0.05）。2.3 骨髓祖細(xì)胞集落產(chǎn)率變化 粒－巨噬系祖細(xì)胞（Clony Forming Unit－Granulocyte，Macrophage，CFU－GM）、晚期紅系祖細(xì)胞（Colonies Forming Unit－Erythrocyte，CFUE）、早期紅系祖細(xì)胞（Burst Forming Unit－Erythrocyte，BFU－E）、巨核系祖細(xì)胞（Colonies Forming Unit－ Megakaryocye，CFU－Meg）集落產(chǎn)率變化見表3。

從表中可以看出：模型小鼠各組的CFU－GM、CFUE、BFU－E祖細(xì)胞集落產(chǎn)率均極顯著低于正常小鼠（P＜0.01）；右歸丸組CFU－GM集落產(chǎn)率高于模型空白和模型鹽水組（P＜0.05）；左歸丸CFU－E集落產(chǎn)率高于模型空白和模型鹽水組（P＜0.05）；生理鹽水組和空白組的CFU－Meg集落產(chǎn)率顯著低于正常小鼠（P＜0.05），但左、右歸丸組與正常小鼠相比無顯著差異（P＞0.05），左歸丸組的CFU－Meg集落產(chǎn)率還顯著高于生理鹽水組（P＜0.05）。

表3 灌胃左、右歸丸后低出生體重小鼠骨髓造血祖細(xì)胞集落產(chǎn)率（/5×410BMC）

表4 灌胃左、右歸丸后低出生體重小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附能力（±s）%

表4 灌胃左、右歸丸后低出生體重小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞粘附能力（±s）%

*：p＜0.05，與正常組相比，△：p＜0.05，與模型空白組相比，☆：p＜0.05，與生理鹽水相比

組別 正常 空白 生理鹽水 左歸丸 右歸丸7d 30.07±3.50 22.41±4.17* 21.94±5.07* 20.07±6.77*△☆ 29.35±5.89△☆*14d 34.27±3.77 22.10±4.60* 23.18±6.34* 29.90±6.75△ 31.21±7.88△☆21d 34.02±4.02 22.48±5.36* 21.98±4.92* 30.05±9.01☆ 32.201±7.22△☆

2.4 骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附力 可見，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，空白組和生理鹽水組的基質(zhì)細(xì)胞對(duì)正常骨髓細(xì)胞的黏附能力均顯著低于正常組（P＜0.05），在培養(yǎng)第7天，左、右歸丸組基質(zhì)細(xì)胞黏附能力均顯著高于模型空白和模型鹽水組（P＜0.05），但均顯著低于正常組（P＜0.05）；在培養(yǎng)第14天和21天時(shí)，時(shí)，左右歸丸組與正常組相比無差異（P＞0.05）；在14天時(shí)，左歸丸高于空白組，右歸丸高于空白和生理鹽水組（P＜0.05）；在21天時(shí)，左歸丸高于生理鹽水，右歸丸高于空白和生理鹽水組（P＜0.05）。詳見表4。

3 討論

祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為：腎中所藏先天之精，稟受于父母，與生俱來，是人類生命的本原，“人始生，先成精”，故腎為先天之本。在胚胎發(fā)育和臟腑器官形成乃至于出生后的生命歷程中，先天之精不斷地由腎輸注于各臟腑器官，在后天之精的充養(yǎng)下，維持著各個(gè)臟腑組織器官的形態(tài)和功能穩(wěn)定，若先天之精異常，則會(huì)導(dǎo)致稟賦異常，繼而產(chǎn)生相應(yīng)的出生缺陷［7］。低體重兒是由于母親在懷孕后熟人，營養(yǎng)不良或疾結(jié)果病因素等安排導(dǎo)致協(xié)和胎兒發(fā)育遲緩，在出生時(shí)體重過低，見到皮下脂肪少，保溫能力拼命差，呼吸機(jī)能和代謝機(jī)能溝通弱，窮人專門容易感染疾病，死亡率比體重副作用正常的新生兒高，其智力發(fā)展也會(huì)受到一定的影響［8］關(guān)系。因此“低出生體重”是一種典型的先天之精不足導(dǎo)致的出生缺陷。

我們采用孕鼠饑餓法對(duì)受孕前后的雌鼠進(jìn)行飲食限制，結(jié)果得到的新生小鼠平均體重顯著低于正常新生小鼠，正常喂養(yǎng)10周后，低出生體重小鼠骨髓有核細(xì)胞數(shù)、骨髓CFU－GM、CFU－E、BFU－E祖細(xì)胞集落產(chǎn)率、骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)的7、14、21天的黏附能力均顯著低于正常組，提示用孕鼠饑餓法可以得到出生體重和我們所檢測的部分生理指標(biāo)均低于正常組的“先天之精不足”小鼠。

最原始的干細(xì)胞是胚胎干細(xì)胞，又稱為全能干細(xì)胞，其稟受于父母，父母的生殖之精結(jié)合為受精卵，再由受精卵分裂出胚泡的內(nèi)細(xì)胞群，新個(gè)體所有的組織細(xì)胞均由該群細(xì)胞分化、分裂而來，其中任何一個(gè)內(nèi)細(xì)胞群的細(xì)胞在適宜的條件下均可分化成為身體的任何一種組織細(xì)胞，故該群細(xì)胞被稱為胚胎干細(xì)胞或全能干細(xì)胞。隨著胚胎的發(fā)育和臟腑器官的分化和成熟，胚胎干細(xì)胞逐漸失去了全面分化的能力，而逐漸遷移到各種器官組織中（五臟皆藏先天之精和后天之精）成為特定的組織干細(xì)胞（造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、生殖干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、皮膚干細(xì)胞等），組織干細(xì)胞通過分裂和多向分化，成為這些組織器官生長、發(fā)育、修復(fù)的原始基礎(chǔ)（先天生后天）。組織干細(xì)胞在后天所得到的水谷精微的充養(yǎng)下，能夠以不對(duì)稱分裂的形式得以自我更新（后天養(yǎng)先天），維持著數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡，從而保證了機(jī)體器官和臟腑組織正常的形態(tài)和功能的維持［9］?？梢姼杉?xì)胞與先天之精在來源、功能和充養(yǎng)（維持）上均具有共通點(diǎn)，為此有作者認(rèn)為干細(xì)胞可能是先天之精在細(xì)胞層面的存在形式，并提出從干細(xì)胞角度研究腎精的思路［10－12］。

腎精具有生髓化血的作用：腎精生髓，充養(yǎng)于骨，髓亦可以轉(zhuǎn)化為血成為血液的生成來源之一“血即精之屬也”。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示所有的造血細(xì)胞均來源于胚胎時(shí)期就已具備的造血干細(xì)胞，在人的一生中，造血干細(xì)胞通過自我更新、不斷分裂和多向分化，維持著血細(xì)胞數(shù)量的動(dòng)態(tài)平衡。因此造血干細(xì)胞是研究干細(xì)胞與腎精關(guān)系的突破點(diǎn)之一。在哺乳動(dòng)物，造血干細(xì)胞主要存在于骨髓有核細(xì)胞群中。

左、右歸丸是祖國醫(yī)學(xué)常用的補(bǔ)益劑［13］，分別具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓和溫補(bǔ)腎陽、填精益髓的功效。為此，我們以干細(xì)胞即是先天之精、腎精生髓化血為理論指導(dǎo)，首次研究了左、右歸丸對(duì)“先天之精不足”之低出生體重小鼠骨髓有核細(xì)胞細(xì)胞數(shù)量、骨髓造血細(xì)胞增殖能力、骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附能力的影響，結(jié)果顯示右歸丸組的骨髓有核細(xì)胞數(shù)量、CFU－GM集落產(chǎn)率、7、14、21天的基質(zhì)細(xì)胞黏附能力均顯著高于生理鹽水組；左歸丸組CFU－E、CFU－Meg集落產(chǎn)率、7、21天的基質(zhì)細(xì)胞黏附能力顯著高于生理鹽水組，但左右歸丸組的各項(xiàng)檢測指標(biāo)間均沒有顯著性差異。提示左、右歸丸能不同程度、不同角度地促進(jìn)低出生體重小鼠骨髓細(xì)胞數(shù)量提高和功能恢復(fù)，這是左、右歸丸對(duì)“先天之精不足”小鼠發(fā)揮“補(bǔ)腎”作用的途徑之一。

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R289.5

A

1007－8517（2013）03－0019－03

2012.12.25）

成都中醫(yī)藥大學(xué)科技基金重點(diǎn)項(xiàng)目（NO：ZRZD200903）。

黃曉芹，教授、博士，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)。E－mail：hxq196899＠sina.com。