對(duì)核仁組成區(qū)嗜銀蛋白外周血染色的探討

鐘禮瀑，萬(wàn)祥輝

(1、江西省腫瘤醫(yī)院輸血科，南昌330029；2、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330029)

·實(shí)驗(yàn)研究·

對(duì)核仁組成區(qū)嗜銀蛋白外周血染色的探討

鐘禮瀑1，萬(wàn)祥輝2

(1、江西省腫瘤醫(yī)院輸血科，南昌330029；2、江西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌330029)

目的探索一種簡(jiǎn)便實(shí)用的能直接應(yīng)用于外周血的核仁組成區(qū)嗜銀蛋白染色方法。方法取25mm×55mm的雙層濾紙貼蓋于經(jīng)固定的血片上，自然光條件下滴加按1：2現(xiàn)配的銀膠溶液，放暗盒內(nèi)30℃水浴染50min，水洗晾干，先低倍找到最佳部位后換油鏡觀察血膜染色后視野內(nèi)背景清潔度、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和銀染顆粒著色情況，并另作30 min和40 min同等條件對(duì)照。結(jié)果本法采用濾紙貼蓋血膜面后，染液完全擴(kuò)散于濾紙的時(shí)間較未用濾紙時(shí)以手工完全鋪展液面的時(shí)間(即染色前試劑曝光時(shí)間)明顯縮短，且利用了濾紙的過(guò)濾功能，使視野中雜質(zhì)沉淀大為減少；適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間能使細(xì)胞和銀染顆粒著色程度加深，更易于檢測(cè)識(shí)別。結(jié)論經(jīng)此改進(jìn)后的銀染法可用于自然光條件下血片嗜銀蛋白直接染色，適于各級(jí)醫(yī)療機(jī)構(gòu)應(yīng)用。

外周血；核仁組成區(qū)嗜銀蛋白；染色法

核仁組成區(qū)嗜銀蛋白(argyrophilic nucleolar organizer region proteins簡(jiǎn)稱(chēng)AgNOR)是rDNA轉(zhuǎn)錄過(guò)程中的調(diào)節(jié)蛋白，在核糖體和蛋白質(zhì)的合成中起著重要作用。近些年，有關(guān)AgNOR在腫瘤病理診斷中的研究也不時(shí)可見(jiàn)報(bào)道，而其中的銀染法由于其簡(jiǎn)單方便運(yùn)用較多，但從報(bào)道來(lái)看，不管是在組織還是血膜中的應(yīng)用其染色時(shí)間和溫度仍不盡相同[1-6]。由于試劑的光不穩(wěn)定性，在不避光條件下直接滴加銀染應(yīng)用液難免會(huì)受光分解，并在著色背景中產(chǎn)生大量棕黑色顆粒而妨礙檢測(cè)。為了克服這種現(xiàn)象，尋找一種能在自然光條件下應(yīng)用于外周血膜的銀染方法，我們對(duì)此做了一些探索，經(jīng)多次使用效果良好，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料(1)先將88%的分析純甲酸以重蒸水配成1%的溶液，再稱(chēng)2g生化試劑明膠充分溶于100ml此液中成2%的甲酸明膠溶液(簡(jiǎn)稱(chēng)A液)；最后稱(chēng)50g分析純硝酸銀充分溶于100ml重蒸水中(簡(jiǎn)稱(chēng)B液)，存于棕色磨口瓶中；(2)把雙層潔凈慢速定性濾紙緊貼著裁成25mm×55mm備用；(3)帶秒表功能的Nokia 1208手機(jī)一部。

1.2 方法

1.2.1 操作過(guò)程(1)吸取病人未抗凝新鮮血液，迅即推制12張血片，其中6張編1～6號(hào)以無(wú)水甲醇(分析純)固定5 min，潔凈自來(lái)水柔緩淋洗30s后晾干；(2)取備用的雙層濾紙貼放于其中1～3號(hào)(A組)血片上，另4～6號(hào)(B組)不放濾紙作同等條件對(duì)照，于每張玻片25㎜×55㎜面積內(nèi)加600 μl計(jì)算所需應(yīng)用液，按A液與B液1：2吸取各溶液量，立即放于干燥潔凈棕色瓶中，充分混勻成應(yīng)用液；(3)迅速吸應(yīng)用液600μl分別加到A、B兩組標(biāo)本上，加液時(shí)啟動(dòng)秒表，當(dāng)A組應(yīng)用液自行擴(kuò)散和B組手動(dòng)鋪散于整個(gè)標(biāo)本面時(shí)，終止計(jì)時(shí)(以便計(jì)算A、B兩組單個(gè)標(biāo)本蓋滿液面的時(shí)間，即染色前試劑曝光時(shí)間)，立即放暗盒內(nèi)在30℃水浴箱作用50min；(4)染色完畢，以潔凈自來(lái)水輕柔淋洗30s，晾干，先低倍鏡找到細(xì)胞分布均勻的部位后再換油鏡觀察每份標(biāo)本視野背景的清潔度、紅白細(xì)胞和銀染顆粒著色程度。另6張血片分別編7～9號(hào)(C組)與10～12號(hào)(D組)，在上述同樣方法和條件(但不計(jì)試劑曝光時(shí)間)下分別染色30min和40min(以便與A組對(duì)照觀察紅細(xì)胞、白細(xì)胞核、白細(xì)胞質(zhì)和銀染顆粒著色程度)，水洗晾干鏡檢。

1.2.2 標(biāo)本鏡檢時(shí)視野內(nèi)背景清潔度、細(xì)胞和銀染顆粒著色程度判斷標(biāo)準(zhǔn)(1)視野中背景清潔度判斷標(biāo)準(zhǔn)：每份標(biāo)本觀察10個(gè)視野，以7個(gè)(含)以上視野的結(jié)果作為該標(biāo)本最終結(jié)果，在視野背景中無(wú)顆粒或僅極少量塵粒狀沉淀為-，當(dāng)有G+球菌狀暗褐色顆?；驂m粒狀沉淀增多，但＜1/5視野面積為+，當(dāng)G+球菌狀暗褐色顆粒或塵粒狀沉淀占視野面積1/5～2/5為2+，當(dāng)G+球菌狀暗褐色顆?；驂m粒狀沉淀占視野內(nèi)面積＞2/5～3/5為3+，當(dāng)G+球

菌狀暗褐色顆?；驂m粒狀沉淀占視野內(nèi)面積＞3/5～4/5為4+，G+球菌狀暗褐色顆?；驂m粒狀沉淀占視野面積＞4/5～5/5(滿視野)為5+；(2)細(xì)胞和銀染顆粒著色程度判斷標(biāo)準(zhǔn)：每份標(biāo)本觀察10個(gè)視野，以7個(gè)(含)以上視野內(nèi)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)與銀染顆粒未著色為“-”，呈黃白色為±，呈檸檬黃為+，呈桔黃色為2+，呈金黃或暗紅色為3+，呈棕黑色為4+。

2 結(jié)果

2.1 A組滴加應(yīng)用液后染液自行擴(kuò)散和B組手動(dòng)助其鋪散的時(shí)間比較滴加應(yīng)用液后1～3號(hào)標(biāo)本染液自行完全擴(kuò)散的時(shí)間分別為10.22s、9.19s和9.06s，平均9.63s；4～6號(hào)標(biāo)本手動(dòng)助染液完全鋪散的時(shí)間分別為19.41s、13.59s和15.09s，平均16.03s；

2.2 鏡檢時(shí)視野內(nèi)背景清潔度在鏡下A組標(biāo)本視野內(nèi)背景清潔度均為-，B組標(biāo)本視野內(nèi)背景清潔度均為5+；

2.3 雙層濾紙貼蓋染色30 min、40 min、50 min后紅細(xì)胞、白細(xì)胞核、白細(xì)胞質(zhì)和銀染顆粒著色程度(1)30min染色后C組3份標(biāo)本視野內(nèi)紅細(xì)胞為-、白細(xì)胞核為±、白細(xì)胞質(zhì)為-，銀染顆粒為-；(2) 40min染色后D組3份標(biāo)本視野內(nèi)紅細(xì)胞為±、白細(xì)胞核為+、白細(xì)胞質(zhì)為-，銀染顆粒為+；(3)50min染色后A組3份標(biāo)本視野內(nèi)紅細(xì)胞為+、白細(xì)胞核為2+、白細(xì)胞質(zhì)為±，銀染顆粒為3+。3種不同染色時(shí)間具體染色效果見(jiàn)表1。

表1 30 min、40min、50 min3種不同染色時(shí)間雙層濾紙貼蓋染色效果對(duì)照

3 討論

AgNOR銀染一步法因無(wú)需特殊儀器，試劑組成中的硝酸銀和明膠也易得，操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，人們樂(lè)于采用，但在有自然光的條件下要染出效果良好的血片并非易事，因硝酸銀液一旦遇光即分解析出，產(chǎn)生沉淀，加上明膠溶液本身具有一定的黏附性，會(huì)促使沉淀的聚積，導(dǎo)致在染過(guò)的標(biāo)本內(nèi)形成大量沉渣，嚴(yán)重干擾銀染顆粒的檢測(cè)。故在無(wú)暗室條件下染色若要減少沉淀形成，就必須盡量縮短試劑染色前曝光時(shí)間。本實(shí)驗(yàn)采用雙層濾紙貼蓋血膜染色，干燥濾紙的強(qiáng)烈吸水性和其致密纖維網(wǎng)孔具有的巨大表面積對(duì)試劑的虹吸作用均能使試劑以極快的速度擴(kuò)散于整個(gè)血膜，其擴(kuò)散速度明顯快于手工鋪散試劑的速度，縮短了染色前試劑的曝光時(shí)間，濕潤(rùn)后的濾紙既可防止試劑蒸發(fā)干燥，還能濾除已形成的顆粒，這些作用相互疊加可大大減少沉淀生成，使染色背景變得清爽。在反應(yīng)時(shí)間上，雖本法較有的報(bào)道[2-4]在染色時(shí)間上略長(zhǎng)數(shù)分鐘，但本法免除了復(fù)染水洗等程序，節(jié)省了試劑和后續(xù)過(guò)程所需的時(shí)間。再則，由于銀染陽(yáng)性呈現(xiàn)的黃色不甚醒目，觀測(cè)的銀染顆粒往往較微小，中性粒細(xì)胞核質(zhì)較淋巴細(xì)胞核質(zhì)疏松，其著色也較淋巴細(xì)胞核略淺，本著染色效果優(yōu)先的原則，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)50 min染色后，紅細(xì)胞、白細(xì)胞核和銀染顆粒的著色程度均比其染色時(shí)間短的兩組深染，故我們認(rèn)為在30℃的常溫條件下染50 min能更好地體現(xiàn)出本染色的應(yīng)用價(jià)值，適于各級(jí)醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)推廣。

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R446.11+1

A

1674-1129(2013)02-0131-02

10.3969/j.issn.1674-1129.2013.02.009

江西省衛(wèi)生廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(20091216)

鐘禮瀑,男,本科,學(xué)士,主任技師,擅長(zhǎng)血液細(xì)胞形態(tài)、生化和輸血檢驗(yàn)技術(shù)。