寧波地區(qū)蔬菜主要病原線蟲的分離和種類鑒定

姚紅燕， 顧建鋒， 王江嶺， 陳若霞

（1．寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波 315040；2．寧波檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 寧波 315010）

由植物寄生線蟲侵襲和寄生引起的植物病害稱為植物病原線蟲病。據(jù)Esser的統(tǒng)計，到1990年為止全世界已報道發(fā)現(xiàn)植物寄生線蟲207個屬，共4 832種［1］。危害植物的線蟲主要有根結(jié)線蟲、孢囊線蟲、滑刃線蟲、莖線蟲、粒線蟲及短體線蟲等。據(jù)Sasser ＆Freek man報道，植物寄生線蟲每年造成世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失約1 000億美元［2］。其中危害最嚴重的是根結(jié)線蟲（Meloidogyne Goeldi，1987），有90余種，而常見的4種根結(jié)線蟲包括南方根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲（M．hapl a Chit wood）、爪哇根結(jié)線蟲［M．j avanica（Treub）］和花生根結(jié)線蟲［M．a(chǎn)renaria（Neal）］，蔬菜一旦被侵染，植株生長緩慢、葉片發(fā)黃，植株萎蔫，一般減產(chǎn)10%～20%，嚴重時達到75%以上［3］。咖啡短體（根腐）線蟲是三類檢疫性線蟲，屬寄主根系皮層的遷徙性內(nèi)寄生線蟲，受害根系出現(xiàn)淺褐色病斑，伴隨次生病原物，造成根系根腐。國內(nèi)主要采用形態(tài)學(xué)特征即雌成蟲會陰花紋進行植物病原線蟲種類鑒定，國外多采用形態(tài)鑒定和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法。病原線蟲對不同的寄主植物具有一定的專化性，準確鑒定病原線蟲種類對選育抗病作物品種和采用防治措施有重要指導(dǎo)意義。因此，本課題組對寧波地區(qū)蔬菜病原線蟲發(fā)生情況進行調(diào)查并進行種類鑒定，以便針對性地進行防治，確保安全生產(chǎn)。

1 材料與方法

1．1 試驗材料

在寧波地區(qū)選取鎮(zhèn)海九龍湖、寧波梅墟、慈溪周巷、慈溪龍山、江北費市、寧海冠莊、北侖小港、余姚泗門、奉化江口等有設(shè)施蔬菜農(nóng)業(yè)或蔬菜產(chǎn)量較大的農(nóng)場，對各種蔬菜根系和周邊土壤取樣檢測。

1．2 試驗方法

1．2．1 病害分級標準

在各蔬菜基地采用對角線取樣法，調(diào)查10點，每點取樣2株，共20株，調(diào)查病情指數(shù)及發(fā)病率。

根結(jié)線蟲危害的記載標準，病情指數(shù)采用切根百分數(shù)法［4］：

0級 無根瘤；

1級 根瘤總長度占總根長度的1%～24%；

2級 根瘤總長度占總根長度的25%～49%；

3級 根瘤總長度占總根長度的50%～74%；

4級 根瘤總長度占總根長度的75%～100%。

1．2．2 土壤病原線蟲分離方法

土壤中線蟲的分離采用以下兩種方法。

改良漏斗法：取土樣約250 g，用雙層紗布包好，改良漏斗法分離線蟲。25℃左右靜置24 h后，接取線蟲液約10 mL鏡檢。

淘洗過篩離心法［5］：稱取土樣100 g，倒入水盆中，加水攪勻，靜置1 min。將水倒入一組網(wǎng)篩，即上層為60目，下層為400目，邊倒邊振蕩分樣篩，防止水充滿下層的400目篩而從篩中溢出。然后，再在盆中加入水后混勻，靜置1 min，倒入網(wǎng)篩中，如此重復(fù)3次。將400目的分樣篩取下，用噴頭把400目網(wǎng)篩中的線蟲懸液中的泥漿沖洗干凈，倒入燒杯中，靜置。將靜置燒杯中的上層水輕輕倒掉，只保留下層大約30 mL水、線蟲和泥漿的混合物。將混合物輕輕搖勻，倒入離心管中，在天平上調(diào)平衡，把平衡后的離心管放入離心機中，第一次離心（離心機的轉(zhuǎn)速2 000 r／min，離心時間為4 min）。倒掉第一次離心后離心管內(nèi)的上層液，保留土層。在離心管中分別注入比重為1．18 g／L的蔗糖溶液約10 mL，在天平上調(diào)平衡后，搖勻，放入離心機中進行第二次離心（離心機的轉(zhuǎn)速2 000 r／min，離心時間為1 min）。離心后，迅速取出離心管，把離心管內(nèi)的上層液倒入500目篩中，用水把蔗糖液沖掉，以防線蟲在蔗糖液中脫水變形。然后把線蟲液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，鏡檢。

1．2．3 植物病原線蟲鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：用De Man公式法對會陰花紋、2齡幼蟲、雄蟲觀察和測計，雌蟲會陰花紋制作方法參見劉維志等［6］。

分子生物學(xué)鑒定：用單條2齡幼蟲提取DNA［7］。將單條線蟲放入dd H2O清洗，挑取單條放入200μL PCR管中（含8μL dd H2O和1μL 10×PCR Buffer（Mg2＋free）），液氮中放置1 min，85℃加熱2 min，向PCR管中加入1μL 1 mg／mL蛋白酶K，56℃加熱15 min，95℃加熱10 min，得到DNA提取液直接進行PCR擴增。

對mt DNA的COⅡ和l RNA基因間序列，采用1對引物進行擴增：上游引物為C2F3：GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG，下游引物為1108：TACCTTTGACCAATCACGCT［4］。

PCR擴增采用50μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer（Mg2＋free）5μL，25 mmol／L MgCl25μL，0．1 mmol／L d NTP 4μL，10μmol／L上游引物和下游引物各3μL，5 U／μL Taq酶0．6μL，DNA 提取液3μL，dd H2O補齊50μL。擴增程序：94℃4 min；94℃1 min，50℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，如獲得預(yù)期的PCR產(chǎn)物，則用Hin f I進行限制性酶切反應(yīng)，酶切產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠中電泳分離，再用凝膠圖像分析系統(tǒng)照相。

2 結(jié)果與分析

2．1 寧波病原線蟲田間調(diào)查情況

通過2008年和2012年對寧波主要蔬菜基地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)：江北費市、寧海冠莊、寧波梅墟和鎮(zhèn)海九龍湖發(fā)現(xiàn)有南方根結(jié)線蟲危害癥狀，其余基地未發(fā)現(xiàn)。鎮(zhèn)海九龍湖和寧波梅墟兩地的土壤中均分離到南方根結(jié)線蟲的2齡幼蟲；江北費市分離到咖啡短體線蟲，除這兩種病原線蟲外，還分離到螺旋屬（Helicotylenchus）、真滑刃屬（Aphelenchus）、滑刃屬（Aphelenchoides）、矮化屬（Tylenchor hynchus）、盤旋屬（Rotylenchus）、長尾屬（Seinura）、墊刃屬（Tylenchus）等其他非病原線蟲。南方根結(jié)線蟲的寄主有番茄、黃瓜、豇豆和白菜，咖啡短體線蟲的寄主有蘿卜和大豆。

表1 寧波主要蔬菜基地植物病原線蟲的發(fā)生情況Table 1 The occurrence of plant pathogenic nematodes on main vegetable bases in Ningbo

2．2 南方根結(jié)線蟲的鑒定

根據(jù)獲得的雌蟲會陰花紋、雄蟲和2齡幼蟲的測計值，結(jié)合分子生物學(xué)分析，所有發(fā)現(xiàn)的根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲。

2齡幼蟲：體長390（360～470）μm，口針長11．0（10．1～11．8）μm，半月體在排泄孔前或與其相鄰。尾較細，長47（43～50）μm，末端略鈍圓，透明尾長6～14μm。背食道腺開口距口針基球1．3～2．5μm（圖1）。

雌蟲：蟲體呈梨形，后部不隆起。口針長15～16μm，基部球圓。會陰花紋背弓相對較高，由平滑到波浪形的線紋組成，側(cè)線不明顯。有些會陰花紋發(fā)生變異，背弓變得圓而扁平。背食道腺開口距口針基球2～4μm（圖1）。

圖1 南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲和雌蟲會陰花紋（標尺＝10μm）Fig．1 Second instar larvae of Meloidogyne incognita and perineal patter n of female wor m（Scale＝10μm）

雄蟲：溫熱殺死后蟲體向腹面略彎。體前端較細，后部較粗，尾部彎曲約90°，側(cè)區(qū)有4條側(cè)線。唇區(qū)無明顯縊縮，頭冠與頭區(qū)分界明顯，頭冠比頭區(qū)稍窄，頭區(qū)有2～3條不明顯的環(huán)紋，頭架骨化明顯。口針錐體前端細，后端逐漸加粗，口針桿部圓柱形，上下幾乎等寬?？卺樆驗榍蛐位虮馇蛐巍１呈车老匍_口距口針基球2．9（2．0～3．7）μm。

應(yīng)用COⅡ和ⅠRNA基因間的C2F3和1108這對引物，擴增獲得的PCR產(chǎn)物片段大小為1 700 bp，該產(chǎn)物經(jīng)Hin f I限制性內(nèi)切酶酶切，獲得2條酶切產(chǎn)物，其片段大小為1 300 bp和400 bp（圖2），這與文獻報道一致［8－9］。

圖2 C2F3和1108引物擴增產(chǎn)物的Hin f I酶切結(jié)果Fig．2 PCR products using pri mers C2F3 and 1108 digested by Hin f I enzy me

2．3 咖啡短體線蟲的鑒定

在對寧波地區(qū)采集的土樣調(diào)查時，還從費市的蘿卜和大豆根圍土壤中發(fā)現(xiàn)了一種短體屬線蟲，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法，鑒定為咖啡短體線蟲。該線蟲為植物根部內(nèi)寄生線蟲，對農(nóng)作物危害較大，短體屬非中國種，是我國進境植物檢疫對象，該線蟲未見在寧波發(fā)生的報道。

該線蟲唇環(huán)2條，極個別的唇一側(cè)為3條，唇區(qū)略縊縮；口針基球圓形；受精囊長卵形或近圓形，內(nèi)充滿精子；陰道較直；后陰子宮囊長17～50μm，有細胞分化；尾通常亞圓柱形，無紋，鈍圓，平截或有凹痕，符合咖啡短體線蟲主要鑒定特征（圖3）。

圖3 咖啡短體線蟲形態(tài)特征Fig．3 Mor phological characteristics of Pr atylenchus cof f eae

在獲得單條線蟲的DNA粗提液后，對核糖體28S基因的D2和D3區(qū)，采用1對引物進行擴增：上游引物為D2A：ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG，下游引物為D3B：TCGGAAGGAACCAGCTACTA［10］。其他同上。PCR擴增產(chǎn)物送南京金思瑞公司直接測序，測序結(jié)果用 MEGA 4．0軟件自帶的Clustal W進行比對、拼接和人工校正，然后用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4），采自蘿卜的序列號為KC786880；采自大豆的序列號為KC786881。

28S DNA序列進化關(guān)系分析表明，采自寧波大豆和蘿卜上的線蟲與日本和印尼的2種咖啡短體線蟲聚類成一個分支，進一步確認該線蟲為咖啡短體線蟲。

圖4 部分短體屬線蟲28S DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig．4 Phylogenetic trees based on 28Sr RNA sequences of Pr atylenchus spp．

3 結(jié)論

趙雷等2007－2009年期間，對浙江省不同地區(qū)蔬菜上病原線蟲樣本進行形態(tài)學(xué)鑒定，鑒定出南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲。姚紅燕等在2009年對寧波地區(qū)番茄上根結(jié)線蟲進行形態(tài)學(xué)鑒定，確定為南方根結(jié)線蟲［11］，兩者均未進行分子生物學(xué)鑒定。本研究通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確認寧波主要蔬菜基地存在南方根結(jié)線蟲和咖啡短體線蟲兩種病原線蟲，這對下一步開展抗病育種等針對性的防治措施具有重要價值。

對寧波主要蔬菜基地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，南方根結(jié)線蟲和咖啡短體線蟲的分布均比較集中，如咖啡短體線蟲只出現(xiàn)在江北費市采樣區(qū)，寄主為蘿卜和大豆。南方根結(jié)線蟲分布在江北費市、寧海冠莊、寧波梅墟和鎮(zhèn)海九龍湖4個采樣區(qū)，寄主主要有番茄、黃瓜、豇豆和白菜。南方根結(jié)線蟲在不同寄主上的危害特性基本相同，以側(cè)根和須根最易受害，根系受害后形成大小和形狀不同的瘤狀根結(jié)，根結(jié)之上一般可長出細弱新根，再度感染形成根結(jié)。地上部初期中午萎蔫，早晚恢復(fù)，嚴重者全株枯死；葉片小、葉色變淺、變黃、似缺素癥；落花落果，果實小而畸形。咖啡短體線蟲又稱根腐線蟲，主要危害根系，受害根系出現(xiàn)淺褐色病斑，伴隨次生病原物，造成根系根腐。

根結(jié)線蟲和咖啡短體線蟲的防治目前均采用綜合防治措施，比較有效的農(nóng)業(yè)防治措施是水旱輪作和采用抗病品種，藥劑防治方面目前生產(chǎn)中比較好的防治藥劑是阿維菌素和淡紫擬青霉等生物制劑。

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