逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)草莓潛隱環(huán)斑病毒的研究

張吉紅， 余澍瓊， 徐 瑛， 張慧麗， 陳先鋒＊， 陳劍平， 陳 炯

（1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局，寧波 315012；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，杭州 310021；3.寧波大學(xué)，寧波 315211）

草莓潛隱環(huán)斑病毒（Strawberry latent ringspot virus，SLRSV）隸屬于伴生豇豆病毒科（Secoviridae）［1］，是薔薇科果實(shí)類作物上的重要病害之一，也是國(guó)家質(zhì)檢總局發(fā)布的重要檢疫性有害生物。該病害主要分布在歐洲、美國(guó)和俄羅斯等地區(qū)。SLRSV能侵染種子、種球、塊莖和苗木等，病毒侵染植株后，主要表現(xiàn)為葉片褪綠、畸形、植株矮化、產(chǎn)量以及品質(zhì)下降等現(xiàn)象，嚴(yán)重時(shí)可引起毀滅性災(zāi)害。SLRSV主要通過(guò)長(zhǎng)劍線蟲(chóng)（Xiphinemasp.）傳播，機(jī)械、嫁接和種子均可傳播。目前，SLRSV的檢測(cè)方法主要有指示植物小葉嫁接法、血清學(xué)檢測(cè)和分子生物學(xué)檢測(cè)等。指示植物小葉嫁接法，SLRSV的癥狀表現(xiàn)比較復(fù)雜，同種病毒在不同的指示植物上，癥狀變化比較大，而且該方法對(duì)于病毒種類的鑒定檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)；血清學(xué)檢測(cè)法具有快速簡(jiǎn)便和高通量的優(yōu)點(diǎn)，目前已有10多種草莓病毒或類似病毒可用ELISA進(jìn)行檢測(cè)；另外，實(shí)時(shí)熒光RT－PCR技術(shù)檢測(cè)草莓病毒也有報(bào)道［2］，該方法具有較高的靈敏度和特異性，但是對(duì)設(shè)備和人員技術(shù)能力的要求較高。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop－mediated isothermal amplification，LAMP）作為一種新的核酸擴(kuò)增方法，具有檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。首先，LAMP技術(shù)是呈瀑布式擴(kuò)增，故其擴(kuò)增效率非常高；其次，LAMP識(shí)別靶序列上的6～8個(gè)特異性位點(diǎn)，因此特異性很強(qiáng)；再次，LAMP技術(shù)是在60～65℃恒溫下擴(kuò)增，只要恒溫水浴鍋即可，無(wú)需特殊儀器，所以操作方便，對(duì)設(shè)備要求低；最后，LAMP的整個(gè)反應(yīng)周期只需1～2.5h，檢測(cè)周期非常短?；贚AMP技術(shù)以上的優(yōu)點(diǎn)，本文針對(duì)草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP檢測(cè)方法的建立進(jìn)行了研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 供試材料

含有SLRSV的陽(yáng)性樣品物質(zhì)購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。經(jīng)DAS－ELISA檢測(cè)呈SLRSV陽(yáng)性的百合樣品由上海檢驗(yàn)檢疫局提供。番茄環(huán)斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）、香石竹環(huán)斑病毒（Carnation ringspot virus，CRSV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）、南芥菜花葉病毒（Arabis mosaic virus，ArMV）以及馬鈴薯V病毒（Potato virus V，PVV）等陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也都購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

RT－LAMP引物由上海英駿生物技術(shù)公司合成。核酸提取試劑Trizol購(gòu)自上海生物工程公司。RT－LAMP擴(kuò)增試劑盒由本實(shí)驗(yàn)室研制。One－step RNA PCR kit與DL－2000marker購(gòu)自大連 TaKa－Ra公司。

引物序列見(jiàn)表1，根據(jù)GenBank（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov）中已登錄的草莓潛隱環(huán)斑病毒的外殼蛋白基因序列（AY860979），采用Blast程序進(jìn)行同源性比較，在序列的保守區(qū)，使用Primer Express 3.0軟件，設(shè)計(jì)得到F3、B3、FIP（F1c＋TTTT＋F2）、BIP（B1c＋TTTT＋B2）、Loop1和Loop2共6條引物，分別識(shí)別外殼蛋白編碼基因的8個(gè)位點(diǎn)。

表1 草莓潛隱病毒RT－LAMP檢測(cè)引物Table 1 The RT－LAMP primers for identification of SLRSV

1.2 草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP擴(kuò)增

總RNA提?。翰捎肨rizol試劑方法提取［3］。

反應(yīng)體系：2×RT－LAMP Mix 10μL，引物F3和B3各為0.2μmol／L，Loop1和Loop2的終濃度各為0.8μmol／L，F(xiàn)IP和BIP的終濃度各為1.6μmol／L，Bst DNA聚合酶（5U／μL）1.5μL，AMV RNA 聚合酶（5U／μL）1μL，模板 RNA 1μL，用ddH2O補(bǔ)充至總體積20μL。

LAMP反應(yīng)液配制完成后，取SYBR green I（10000×）染色劑0.1μL加至反應(yīng)管的管蓋上，待反應(yīng)結(jié)束，離心反應(yīng)管使染色劑與反應(yīng)產(chǎn)物混合。當(dāng)擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，反應(yīng)液呈綠色，結(jié)果為陰性時(shí)呈橙紅色。在紫外燈下，陽(yáng)性樣品管發(fā)出白色熒光，無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品管沒(méi)有白色熒光。

反應(yīng)條件如下：在恒溫60℃的水浴鍋中擴(kuò)增1h。

RT－LAMP結(jié)果分析：反應(yīng)結(jié)束后，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，在GelDoc－2000（Bio－Rad）凝膠成像系統(tǒng)上觀察并記錄結(jié)果。

1.3 RT－LAMP的檢測(cè)反應(yīng)條件優(yōu)化試驗(yàn)

以草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測(cè)方法，分別在60、63℃和65℃3個(gè)溫度條件下進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)時(shí)間為1h。每個(gè)溫度條件設(shè)置2個(gè)RNA樣品重復(fù)，一個(gè)空白對(duì)照。

以草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA為模板，按照建立的RT－LAMP檢測(cè)方法，分別在30、60min和90min 3個(gè)時(shí)間條件下進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)溫度為60℃。每個(gè)時(shí)間條件設(shè)置2個(gè)RNA樣品重復(fù)，一個(gè)空白對(duì)照。

1.4 RT－LAMP的特異性和靈敏度試驗(yàn)

抽提 得 到 SBMV、BPMV、SMV、TRSV 以 及ToRSV等病毒RNA，按照建立的ArMV RT－LAMP檢測(cè)方法，進(jìn)行特異性研究。健康大豆種子提取液作為陰性對(duì)照。

以 ToRSV、CRSV、CGMMV、ArMV 以及 PVV等多種植物病毒RNA為模板，按照建立的草莓潛隱環(huán)斑病毒RT－LAMP檢測(cè)方法，進(jìn)行特異性研究。其中，草莓潛隱環(huán)斑病毒設(shè)置2個(gè)RNA樣品重復(fù)，其余病毒設(shè)置1個(gè)RNA樣品，并設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照。

將提取好的草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA模板進(jìn)行10倍系列稀釋，得到10－1～10－5稀釋的病毒RNA樣品。采用建立的RT－LAMP和RT－PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增靈敏度比對(duì)試驗(yàn)。

1.5 草莓潛隱環(huán)斑病毒RT－PCR檢測(cè)方法的建立

RT－PCR 反 應(yīng) 體 系 參 照 One－step RNA PCR kit試劑盒說(shuō)明進(jìn)行，其中引物為F3和B3。反應(yīng)條件如下：50℃cDNA合成30min，94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，58℃復(fù)性30s，72 ℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5min。

1.6 RT－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的觀察

將靈敏度試驗(yàn)中的RT－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳法觀察擴(kuò)增結(jié)果，剩下的產(chǎn)物中，直接加入0.1μL的熒光染料SYBR green I，混勻后肉眼觀察顏色變化，或置于凝膠成像系統(tǒng)中紫外觀察。

1.7 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測(cè)

取已用DAS－ELISA檢測(cè)呈SLRSV陽(yáng)性的進(jìn)境百合樣品，采用本研究建立的RT－LAMP方法進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果采用SYBR green I染色觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT－LAMP的檢測(cè)反應(yīng)溫度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在相同反應(yīng)時(shí)間，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的草莓潛隱環(huán)斑病毒的引物在60、63℃和65℃均出現(xiàn)明顯的條帶（圖1），擴(kuò)增產(chǎn)物亮度在3個(gè)不同溫度之間沒(méi)有明顯的差異，反應(yīng)溫度最終確定為60℃。

圖1 SLRSV RT－LAMP方法的溫度優(yōu)化Fig.1 Optimization of temperature in RT－LAMP for SLRSV

2.2 RT－LAMP的檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

在60℃時(shí)，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的草莓潛隱環(huán)斑病毒的引物在60min和90min均出現(xiàn)明顯的條帶（圖2），但在30min條件下未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，反應(yīng)時(shí)間確定為60min。

圖2 SLRSV RT－LAMP檢測(cè)的時(shí)間優(yōu)化Fig.2 Optimization of time in RT－LAMP for SLRSV

2.3 草莓潛隱環(huán)斑病毒的RT－LAMP特異性擴(kuò)增結(jié)果

草莓潛隱環(huán)斑病毒的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)RTLAMP擴(kuò)增后，能夠得到特異性的瀑布狀條帶，而其他病毒毒株的RNA模板則無(wú)擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，空白對(duì)照中無(wú)特異性基因條帶（圖3）。這表明本研究設(shè)計(jì)的6條引物針對(duì)SLRSV的檢測(cè)具有非常好的特異性。

圖3 RT－LAMP特異性擴(kuò)增SLRSV結(jié)果Fig.3 Specificity results of LAMP for SLRSV

2.4 RT－LAMP檢測(cè)靈敏度試驗(yàn)

不同稀釋梯度的草莓潛隱環(huán)斑病毒RNA經(jīng)過(guò)RT－LAMP擴(kuò)增后，其檢測(cè)靈敏度為10－3病毒稀釋液，比普通RT－PCR的靈敏度高出100倍（圖4）。

圖4 RT－LAMP和RT－PCR檢測(cè)SLRSV靈敏度結(jié)果Fig.4 Sensitivity results of RT－LAMP and RT－PCR for SLRSV

2.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果觀察

本研究利用沉淀法和染色法對(duì)LAMP產(chǎn)物進(jìn)行了檢測(cè)。LAMP沉淀較少，肉眼較難分辨沉淀的有無(wú)；LAMP產(chǎn)物中加入SYBR green I染色劑，對(duì)照顏色呈橙紅色，而有擴(kuò)增產(chǎn)物則呈綠色（圖5a）。在紫外燈下觀察，空白對(duì)照和無(wú)RT－LAMP產(chǎn)物的樣品管均沒(méi)有發(fā)出白色熒光，而有RT－LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品管則發(fā)出白色熒光，且白色熒光的亮度與RNA模板濃度的高低成正比（圖5b）。RTLAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，用凝膠電泳法觀察結(jié)果和用熒光染料SYBR green I觀察的結(jié)果一致。

圖5 熒光染料SYBR green I處理RT－LAMP產(chǎn)物的觀察結(jié)果Fig.5 Observation of RT－LAMP products treated by SYBR green I

2.6 百合樣品中SLRSV的RT－LAMP快速檢測(cè)結(jié)果

采用本研究建立的RT－LAMP方法對(duì)百合SLRSV陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè)，并用熒光染料SYBR Green I法觀察，結(jié)果顯示，陽(yáng)性樣品均顯示明顯的綠色。

圖6 RT－LAMP檢測(cè)百合樣品中SLRSV的結(jié)果Fig.6 Detection of SLRSV in the lily by RT－LAMP

3 討論

目前，草莓潛隱環(huán)斑病毒的主要檢測(cè)方法為ELISA和RT－PCR技術(shù)。兩種方法較以前的生物學(xué)接種方法來(lái)說(shuō)，在靈敏度、特異性和檢測(cè)周期等方面已有了很大的進(jìn)步，但是檢測(cè)周期仍然在3.5h以上，耗時(shí)長(zhǎng)，在現(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)方面仍顯不足；另外，RT－PCR技術(shù)在產(chǎn)物擴(kuò)增和結(jié)果判斷方面，均對(duì)設(shè)備要求較高，不便于口岸對(duì)病毒檢測(cè)的快速篩查。

張躍偉等應(yīng)用熒光顯色檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV），結(jié)果顯示，在敏感性檢測(cè)中，RTLAMP與RT－PCR都能檢測(cè)包含靶基因片段的重組質(zhì)粒，熒光顯色劑判斷的結(jié)果與濁度判斷結(jié)果一致［4］；何琳等建立了白斑綜合征病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法，同時(shí)與巢式PCR進(jìn)行了比較分析，結(jié)果為最適反應(yīng)在64℃，恒溫條件60min內(nèi)完成，靈敏度較巢式PCR高出100倍，在1h內(nèi)即可完成檢測(cè)［5］；劉佳等建立的LAMP技術(shù)檢測(cè)菊花中番茄不孕病毒的方法為65℃保溫1h，加入2μL稀釋10倍的SYBR Green I，結(jié)果表明該方法檢測(cè)番茄不孕病毒具有高效、快速和靈敏度高等特點(diǎn)［6］。孫穎杰等建立了牙鲆彈狀病毒環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測(cè)方法，該方法的檢測(cè)限為30fg RNA，比常規(guī)RT－PCR靈敏度高出100倍，與其他病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間短，在1h內(nèi)即可完成檢測(cè)［7］。

LAMP反應(yīng)后打開(kāi)蓋加染色劑及使用凝膠電泳驗(yàn)證會(huì)造成不必要的污染過(guò)程，使結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此本研究LAMP檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化時(shí)采用電泳觀察的方式，以選擇最佳的反應(yīng)體系，從而提高草莓潛隱環(huán)斑病毒檢測(cè)效率。但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中，該方法采用在LAMP反應(yīng)管蓋上滴加SYBR green I染色劑，待反應(yīng)結(jié)束后在不開(kāi)蓋的情況下直接使染色劑與擴(kuò)增產(chǎn)物混合，以此減少反復(fù)開(kāi)蓋而造成的污染問(wèn)題。

本試驗(yàn)的LAMP檢測(cè)方法在1.5h內(nèi)完成了檢測(cè)的全過(guò)程，耗時(shí)短；產(chǎn)物擴(kuò)增只需要恒溫水浴鍋，對(duì)設(shè)備要求低；試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本研究建立的RTLAMP檢測(cè)方法比RT－PCR的靈敏度高出100倍；且特異性好；結(jié)果判斷時(shí)在LAMP反應(yīng)體系中加入0.1μL熒光染料SYBR green I，反應(yīng)結(jié)果通過(guò)肉眼觀察綠色是否生成而進(jìn)行判定，實(shí)現(xiàn)反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè)一步完成，其判斷結(jié)果和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果完全一致，快速準(zhǔn)確方便；另外，本研究取已用DAS－ELISA檢測(cè)呈SLRSV陽(yáng)性的進(jìn)境百合樣品進(jìn)行試驗(yàn)，準(zhǔn)確率達(dá)到100%。本研究建立的方法適合植物中草莓潛隱環(huán)斑病毒的現(xiàn)場(chǎng)篩查及實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。

［1］ Sanfacon H，Iwanami T，Karasev A V，et al.Family Secoviridae.［M］∥King A M Q，Adams M J，Carstens E B，eds.Virus Taxonomy：Ninth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Elsevier／Academic Press， Amsterdam， 2012：881－899.

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