瓜類細(xì)菌性果斑病菌對硫酸銅的敏感性檢測與分析

趙文龍， 楊玉文， 王鐵霖， 蔣 潔， 劉慧芹， 趙廷昌

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室，北京 100193）

瓜 類 細(xì) 菌 性 果 斑 病 （bacterial fruit blotch，BFB）是西瓜和甜瓜上最重要的毀滅性種傳細(xì)菌性檢疫病害，病原菌為西瓜嗜酸菌（Acidovorax citrulli，Ac）。菌株間存在比較豐富的遺傳多樣性，主要分為兩個亞群，亞群Ⅰ主要分離自甜瓜、南瓜等，亞群Ⅱ主要分離自西瓜［1－4］。目前，該病害在美國、澳大利亞、韓國、日本、土耳其及泰國等國家均有發(fā)生。我國的西瓜、甜瓜種植面積和產(chǎn)量都位居世界前列，而且我國是西瓜、甜瓜的重要制種基地，該病害自1998年在我國首次報道以來［5］，已經(jīng)在我國大面積發(fā)生，給西甜瓜種植業(yè)造成了巨大的損失［6］，成為目前我國西甜瓜種植業(yè)生產(chǎn)上亟待解決的問題。

田間防治果斑病的藥劑主要是含銅殺菌劑［7－8］，隨著銅化合物藥劑的使用，菌株對銅的敏感度越來越低，為果斑病的藥劑防治帶來困難。Walcott等［4］對35株果斑病菌銅敏感度進(jìn)行了初步檢測，發(fā)現(xiàn)83%的亞群Ⅰ菌株對硫酸銅不敏感，菌株間對銅敏感性存在差異。目前，國內(nèi)尚沒有關(guān)于果斑病菌株對硫酸銅敏感度的檢測報道，因此作者對實驗室保存的143株菌株的硫酸銅敏感性進(jìn)行了檢測，以確定菌株的硫酸銅敏感濃度，以及不同菌株之間的敏感度差異，為合理使用含銅殺菌劑田間防治該病提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗室保存的143株果斑病菌菌株。其中寄主為甜瓜的菌株71株，寄主為西瓜的菌株71株（含寄主為打瓜的菌株5株），寄主為南瓜的菌株1株；亞群Ⅰ菌株91株，亞群Ⅱ菌株52株（表1）［9］。King’s B（KB）培養(yǎng)基［10］，CuSO4·5H2O購自天津大學(xué)科威公司。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度硫酸銅KB培養(yǎng)基配制

稱取0.3125g CuSO4·5H2O，溶于100mL的蒸餾水，配制0.2%的母液，4℃冰箱保存。分別取母液25.64、52.63、81.08、111.11、142.86、176.47、212.12、250、290.32、333.33、379.31、428.58、481.48、538.46、600mL加入KB培養(yǎng)基成分中，定容至1000mL，配制含有50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750μg／mL 硫酸銅平板的KB培養(yǎng)基。融化培養(yǎng)基，制成含有不同濃度硫酸銅的KB平板。

1.2.2 硫酸銅敏感性測定

將143株果斑病菌株（表1）分批次在KB培養(yǎng)基上于28℃下培養(yǎng)48h后待用。挑取單菌落在含有不同濃度硫酸銅的KB平板上畫線，28℃培養(yǎng)。每個濃度設(shè)3個重復(fù)，以不加硫酸銅的KB平板作為對照，2d后開始觀察菌落生成情況，直至10d，觀察期間若有單菌落生成則判定為不敏感，若無單菌落生成則定為敏感。挑取首次活化的菌株單菌落于KB平板上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)10代后，用同樣方法再次對菌株的硫酸銅敏感性進(jìn)行測定。

表1 143株瓜類細(xì)菌性果斑病菌Table1 143strains of Acidovorax citrulli

續(xù)表1 Table 1（Continued）

2 結(jié)果與分析

2.1 果斑病菌對硫酸銅的敏感性

果斑病菌對不同濃度硫酸銅敏感性的檢測結(jié)果見表2。供試所有菌株在對照和低濃度硫酸銅培養(yǎng)基中均能正常生長，表現(xiàn)為不敏感，因此低于300μg／mL（1.88mmol／L）處理結(jié)果沒有在表中顯示。濃度為300μg／mL時，菌株生成單菌落的時間開始延緩，隨著硫酸銅濃度的增加，部分菌株表現(xiàn)出對硫酸銅敏感（表2）。濃度為300μg／mL （1.88mmol／L）、350μg／mL（2.19mmol／L）時除pslbtw43菌株外所有菌株表現(xiàn)為不敏感，在濃度達(dá)到700μg／mL（4.38mmol／L）時，分離自我國的所有菌株均不能生長，而來自國外亞群Ⅰ的8株菌株在此濃度下仍然能夠生長，表現(xiàn)出良好的抗性，濃度達(dá)到750μg／mL（4.69mmol／L）后所有菌株在培養(yǎng)10d內(nèi)均不能生長。將菌株繼代培養(yǎng)10代后，再一次檢測所有菌株的敏感性，試驗結(jié)果與第一代沒有差異。

表2 果斑病菌對不同濃度硫酸銅敏感性檢測結(jié)果1）Table 2 Sensitivity of 143strains of A.citrulli to copper sulfate

續(xù)表2 Table 2（Continued）

續(xù)表2 Table 2（Continued）

2.2 不同寄主菌株硫酸銅敏感性差異

對不同寄主菌株的硫酸銅敏感性進(jìn)行了統(tǒng)計分析（圖1）。在硫酸銅濃度低于400μg／mL（2.5mmol／L）時，2種寄主上的敏感菌株數(shù)量無顯著差異。濃度為450μg／mL（2.81mmol／L）時，西瓜和甜瓜上的敏感菌株數(shù)量開始增加。500μg／mL（2.13mmol／L）時32%分離自西瓜的菌株不敏感，其中分離自打瓜的菌株全部不能生長，92%分離自甜瓜的菌株不敏感。濃度為500～650μg／mL（2.13～4.06mmol／L）時分離自西瓜和甜瓜的敏感菌株比率無顯著變化。濃度為700μg／mL（4.38mmol／L）時，3%分離自甜瓜的菌株不敏感，但此時仍有7%分離自西瓜的菌株能夠生長，該濃度下不敏感的菌株全部來自于美國（Walcott贈送）。綜合分析表明寄主為甜瓜的菌株比其他寄主的菌株對硫酸銅具有更低的敏感性，即有更高的抗銅性。

圖1 不同硫酸銅濃度下不同寄主菌株的生長比率Fig.1 The growth rate of strains from different hosts under different copper sulfate concentrations

2.3 亞群Ⅰ和亞群Ⅱ菌株硫酸銅敏感性差異

通過對亞群Ⅰ和亞群Ⅱ菌株硫酸銅敏感性的統(tǒng)計分析，結(jié)果表明：硫酸銅濃度低于450μg／mL（2.81mmol／L）時亞群Ⅰ和亞群Ⅱ菌株敏感性沒有差異；在濃度為450μg／mL（2.81mmol／L）時，亞群Ⅱ菌株中對硫酸銅不敏感的菌株所占比例開始顯著降低，在500μg／mL（2.13mmol／L）時所有亞群Ⅱ菌株均不能生長。在濃度為650μg／mL（4.06mmol／L）時，亞群Ⅰ不敏感菌株數(shù)量開始出現(xiàn)較明顯的下降，但仍有82%的菌株不敏感；濃度為700μg／mL（4.38mmol／L）時，有9%亞群Ⅰ菌株不敏感；在750μg／mL（4.69mmol／L）濃度時所有亞群Ⅰ菌株均不能生長。分析結(jié)果表明亞群Ⅰ菌株硫酸銅敏感性顯著低于亞群Ⅱ菌株（圖2）。

圖2 不同硫酸銅濃度下兩組菌株的生長比率Fig.2 The growth rate of strains from different groups under different copper sulfate concentrations

3 討論

通過檢測，確定了143株果斑病菌株的硫酸銅敏感濃度。供試143株果斑病菌菌株包含來自我國西瓜、甜瓜主產(chǎn)區(qū)的10個省市，地理來源豐富、具有代表性，因此試驗結(jié)果可以體現(xiàn)我國果斑病菌菌株的硫酸銅敏感性。試驗采用與Walcott R R相同的檢測方法，且試驗所用部分國外供試菌株也相同。Walcott R R對200μg／mL（1.25mmol／L）硫酸銅濃度下不敏感的菌株并沒有繼續(xù)檢測其硫酸銅敏感濃度；其試驗結(jié)果表明在硫酸銅濃度為100μg／mL（0.63mmol／L）時即有菌株表現(xiàn)為敏感，而本試驗在相同濃度和相同觀察時間下相同供試菌株均表現(xiàn)為不敏感［4］。來自美國的部分菌株在濃度達(dá)到700μg／mL（4.38mmol／L）時仍能夠生長，而來自于我國的菌株在該濃度下均不能生長，該結(jié)果表明美國的菌株對銅有更高的抗性。試驗試圖分析菌株硫酸銅敏感度與時間、地理來源的關(guān)系，但由于相同地點不同時間段菌株的來源與數(shù)量有限，無法得出伴隨銅制劑農(nóng)藥的使用等因素使果斑病菌株的銅敏感度逐年增加的結(jié)論，需要進(jìn)一步進(jìn)行對該病害的監(jiān)測和病原菌的分離檢測。

綜合分析表明寄主為甜瓜的菌株比寄主為西瓜的菌株對硫酸銅具有更低的敏感性，但不是所有寄主為甜瓜的菌株抗銅性都高于其他寄主的菌株。通過對不同亞群菌株硫酸銅的敏感性分析表明，亞群Ⅰ菌株硫酸銅敏感性顯著低于亞群Ⅱ菌株；硫酸銅濃度為500μg／mL（3.13mmol／L）時，亞群Ⅰ菌株只有2%敏感，而亞群Ⅱ菌株100%敏感，且根據(jù)試驗中的觀察，在不同濃度硫酸銅平板上，亞群Ⅰ菌株形成單菌落的速率也高于亞群Ⅱ菌株，表明亞群Ⅱ菌株抗銅性均較弱，因此使用銅制劑防治該亞群果斑病可以獲得更好的效果。造成寄主為甜瓜的菌株比寄主為西瓜的菌株對硫酸銅具有更低的敏感性的原因可能是：通常情況下，甜瓜葉片顯癥明顯，瓜農(nóng)在發(fā)現(xiàn)葉片病斑后，為了防止病害進(jìn)一步暴發(fā)，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，通常選擇第一時間噴灑農(nóng)藥；而西瓜葉片癥狀不明顯，瓜農(nóng)往往不施藥；因此甜瓜較西瓜用藥更加頻繁，使得分離自甜瓜的菌株對銅有更高的抗性。但該原因無法解釋寄主為甜瓜的亞群Ⅱ菌株抗銅性較差，寄主為西瓜的亞群Ⅰ菌株抗銅性較高。顯然以亞群判斷菌株的抗銅性更加科學(xué)與準(zhǔn)確。因此要想真正闡明果斑病菌株間抗銅性差異的原理，需要進(jìn)一步從生理與分子機理上開展研究。本研究僅有一株來自于美國寄主為南瓜的菌株，該菌株對硫酸銅的敏感度為700μg／mL（4.38mmol／L），由于數(shù)量有限無法對南瓜上的菌株硫酸銅敏感性作出判斷，需要進(jìn)一步獲得更多菌株。

田間防治果斑病的主要含銅殺菌劑53.8%氫氧化銅干懸浮劑800倍液，銅濃度約為6.86mmoL／L；47%春·王銅可濕性粉劑800倍液，銅濃度約為5.23mmoL／L。兩種農(nóng)藥的銅含量均高于4.69mmoL／L（750μg／mL），存在濫用現(xiàn)象。在大田發(fā)生病害后，并沒有根據(jù)菌株的不同而設(shè)定使用不同濃度的農(nóng)藥。因此本試驗菌株硫酸銅敏感濃度以及不同亞群和寄主菌株間硫酸銅敏感性差異的確定為科學(xué)合理地選擇果斑病防治方法及使用銅制劑農(nóng)藥濃度提供了理論依據(jù)。合理的使用、選擇農(nóng)藥不僅可以降低成本、減少農(nóng)藥殘留、減少污染、有效地控制病害，更可以減緩菌株對農(nóng)藥抗性提升的速度，提升果斑病的防治效率。供試菌株繼代培養(yǎng)后的檢測結(jié)果沒有差異，表明菌株具有穩(wěn)定的銅抗性。果斑病菌是否存在抗銅性基因目前還不清楚，抗銅機理也尚未研究，在今后的試驗中可以在分子水平對其進(jìn)行研究分析。

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